禽白血病诊断技术.doc

禽白血病诊断技术规程1 范围本规程规定了禽白血病（ALV）临床诊断、实验室诊断的技术要求。本规程适用于辽宁省境内禽白血病的诊断、疫情监测及流行病学调查。本规程中的临床诊断方法为筛选方法，筛选结果为疑似的病禽采集病料进行实验室检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法NY/T 6802003 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验SN/T 11722003 禽白血病琼脂免疫扩散试验J-亚群禽白血病防治技术规范3 临床诊断3.1 临床症状禽白血病病鸡无特异的临床症状，部分患有肿瘤的鸡表现消瘦，头部苍白，并由于肝部肿大而导致患鸡腹部增大。禽白血病感染率高的鸡群产蛋量很低。潜伏期较长，最早可见5周龄鸡发病，但主要发生于18周25周龄的性成熟前后鸡群。总死亡率一般为28，但有时可超过10。3.2 剖检病变特征性病变是肝脏、脾脏肿大，表面有弥漫性的灰白色增生性结节。在肾脏、卵巢和睾丸也可见广泛的肿瘤组织。有时在胸骨、肋骨表面出现肿瘤结节，也可见于盆骨、髋关节、膝关节周围以及头骨和椎骨表面。在骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织。4 实验室诊断4.1 病原分离鉴定4.1.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备取10d12d龄SPF鸡胚按常规方法制备CEF，置于3560平皿或小方瓶中。待细胞单层形成后，减少维持用培养液中的血清至1左右。4.1.2 病料的处理和接种4.1.2.1 病料的处理4.1.2.1.1 血清或血浆样品：从疑似病鸡无菌采血分离血清或血浆。4.1.2.1.2 肝、脾、肾组织样品：取1g2g组织研磨成匀浆后，按1：1加入无菌的PBS，置于1.5 mL离心管中10000r/min离心20min，用无菌吸头取出上清液，移入另一无菌离心管中，再于10000r/min离心20min，按10000IU/ mL量加入青霉素后备用。4.1.2.1.3 传代培养：用胰酶溶液将感染的CEF单层消化后，再作为第2代细胞接种于另一块带有34片载玻片的3560平皿中，继续培养7d。4.1.3 病毒的检测4.1.3.1 间接荧光试验（IFA）：将带有感染的CEF的载玻片取出，用丙酮乙醇（7：3）混合液固定后，用ALV单克隆抗体或单因子血清及FITC标记的抗小鼠或抗鸡Ig标记抗体做间接荧光试验。在荧光显微镜下观察有关呈病毒特异性荧光的细胞。4.1.3.2 聚合酶链式反应（PCR）：从CEF悬液提取基因组DNA作为模板，以特异引物进行扩增，回收产物进行测序；或克隆后测序，将测序结果与已发表的ALV株比较，基因序列同源性应在85以上。4.2 禽白血病病毒P27抗原酶联免疫吸附试验操作方法见NY/T 6802003。4.3 禽白血病琼脂免疫扩散试验操作方法见SN/T 11722003。4.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）4.4.1 材料4.4.1.1 样品的采集与处理无菌采集病鸡的全血、病变组织，在无菌条件下将样品充分研磨，并加入0.04mol/LPBS(pH7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。4.4.1.2 试剂Taq DNA聚合酶；AMV反转录酶；dNTP；DL2000 DNA Marker；琼脂糖；核酸提取试剂Trizol；氯仿；异丙醇；DEPC水；ddH2O；75%乙醇（DEPC水配制）。4.4.2 方法4.4.2.1 样品总RNA的提取4.4.2.1.1 取上清液250L加入用DEPC水处理过的1.5mL离心管中，加入750L Trizol病毒裂解液，颠倒混匀。阳性对照、阴性对照与样品同时提取RNA。4.4.2.1.2 室温静置5min，加入250L氯仿，混匀。4.4.2.1.3 静置2min ，412000r/min离心10min。4.4.2.1.4 小心吸取上清液加入另一干净的用DEPC水处理过的1.5mL离心管中，再加入等体积的异丙醇，混匀。4.4.2.1.5 静置5min ，412000r/min离心10min。4.4.2.1.6 小心倒掉上清液，加入1000L75%的乙醇（用DEPC水配制）；413000r/min离心2min。4.4.2.1.7 小心倒掉上清液，置37温箱5min。4.4.2.1.8 加40L DEPC水溶解，-70保存。4.4.2.2 反转录反应（RT反应）在0.2mlPCR管中配制如下体系：下游引物 1L；RNA模板 1L；5RT Buffer 2L；dNTP（10mM） 1L；RNA酶抑制剂 0.5L；AMV反转录酶 0.5L；DEPC水 4L。以上体系置于42反应1h，冰浴2min。4.4.2.3 PCR反应a) 在0.2mLPCR管中配制如下体系；cDNA 2L； 10PCR Buffer（Mg2+Free） 2.5L； dNTP Mixture（各2.5mM） 2L； 上游引物 1L； 下游引物 1L； MgCI2 1L； Taq DNA聚合酶 0.25L； ddH2O 15.25L。b) 以上体系按下列程序在PCR仪进行反应；95 1 min ；94 45 Sec；55 45 Sec；72 45 Sec。c) 重复上述945572三个步骤共35个循环，7210 min；4结束扩增。PCR产物保存于4冰箱以备电泳。4.4.2.4 电泳4.4.2.4.1 称取1g琼脂糖，加入100mL 1电泳缓冲液。加热溶化后加入5L（10mg/mL）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm。依据样品数选择合适的梳子。待凝胶凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加电泳液直至淹没凝胶。4.4.2.4.2 取68L PCR扩增产物与23L加样缓冲液混匀后加入凝胶孔内，在其中一孔内加入与样品相同体积的DL2000 DNA Marker。4.4.2.4.3 80100V或电流40 mA50mA电泳30 min40min。4.4.2.5 结果判定电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性对照在220bp处有明显的目的条带，而阴性对照无任何条带则实验成立。若被检样品在220bp处有明显条带，可判为阳性；否则为阴性。4.5 组织病理学诊断取发病组织制作病理切片，进行HE染色，可见增生的髓细胞样肿瘤细胞，散在或形成肿瘤结节。髓细胞样瘤细胞形体较大，细胞核呈空泡状，细胞浆较多，可见嗜酸性颗粒。4.6 J-亚群禽白血病酶联免疫吸附试验（ELISA）4.6.1 样品准备检测之前要用样品稀释液将被检样品进行500倍稀释（如：1L的样品可以用样品稀释液稀释到500L）。在将样品加入检测板前要将样品充分混匀。4.6.2 洗涤液制备(10X)浓缩的洗涤液在使用前必须用蒸馏水或去离子水进行10倍稀释。如果浓缩液中含有结晶，在使用前必须将它融化。（如：30mL的浓缩洗涤液和270mL的蒸馏水或去离子水充分混合配成）。4.6.3 操作步骤4.6.3.1 取出抗原包被板并在记录表上标记好被检样品的位置。4.6.3.2 取100L不需稀释的阴性对照液加入A1孔和A2孔中。4.6.3.3 取100L不需稀释的阳性对照液加入A3孔和A4孔中。4.6.3.4 取100L稀释的被检样品液加入相应的孔中。所有被检样品都应进行双孔测定。4.6.3.5 室温下孵育30min。4.6.3.6 每孔加约350L用蒸馏水或去离子水10倍稀释的洗涤液洗板，洗35次。4.6.3.7 每孔加100L的酶标羊抗鸡抗体（HRPO）。4.6.3.8 室温下孵育30min。4.6.3.9 重复第4.6.3.6步。4.6.3.10 每孔加100L的TMB底物液。4.6.3.11 室温下孵育15min。4.6.3.12 每孔加100L的终止液。4.6.3.13 酶标仪空气调零。4.6.3.14 测定并记录各孔于650nm波长的吸光值（A650）。4.6.4 结果判定4.6.4.1 阳性对照平均值和阴性对照平均值的差值大于0.10，阴性对照平均值小于或等于0.150，该检测结果才能有效。4.6.4.2 被检样品的抗体水平由其测定值与阳性对照测定值的比值（S/P）确定。抗体滴度按下列方程式进行计算。阴性对照平均值NC=A1（A650）+A2（A650）/2；阳性对照平均值PC=A3（A650）+A4（A650）/2；S/P比值=（样品平均值-NC）/（PC -NC ）。4.6.4.3 S/P比值小于或等于0.6，判为阴性。4.6.4.4 S/P值大于0.6，判为阳性，表明被检血清中存在J-亚群禽白血病病毒抗体。AABB附录A （资料性附录）附录A 引物序列及扩增基因A.1 引物序列引物名称特异性引物的核苷酸序列ALV正5-AAGTAAGGTGGTACGATCGTG-3ALV反5-CTGCTTCATTCAGGTGTTCGCAAT-3引物合成后，加DEPC水配制成25mol/L。A.2 扩增的目的基因禽白血病病毒LTR (长末端重复)序列。CC附录B （资料性附录）附录B 溶液的配制B.1 PBS（磷酸盐缓冲液）的配制B.1.1 0.1mol/L PBS氯 氯化钠（NaCI）80.0g氯化钾（KCI）2.0 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）30.0 g磷酸二氢钾（KH