第9章 难治性急性髓细胞白血病.doc

第九章 难治性急性髓细胞白血病急性髓细胞白血病（AML）是一组骨髓造血干/祖细胞分化停滞于较早期髓系原始、幼稚细胞的肿瘤性疾病，其发病机制尚不完全清楚，但在许多情况下，由于染色体易位或其他遗传学异常，从而激活异常基因而发病。这种分化停滞可导致两种病理过程：首先，正常血细胞生成减少，引起不同程度的贫血、血小板减少和中性粒细胞减少，第二，肿瘤细胞增殖加快，同时凋亡减少，从而蓄积于各种器官。本病起病急、自然病程短，临床上以贫血、出血、发热、肝脾肿大和外周血或/和骨髓可见多量异常的原始和幼稚细胞为特征。近年来，对本病的病理生理学认识已有明显的改善，同时开拓了一些新的治疗方法。尽管如此，目前的治疗结果仍然不满意，尤其在老年患者和原发难治或复发的患者。一、难治原因分析（一）诱导缓解治疗的疗效难以进一步提高除了急性早幼粒细胞白血病（APL）以外，目前其他类型AML诱导缓解治疗的标准方案仍然是“3+7”方案（3天蒽环类药物+7天阿糖胞苷）。诱导缓解治疗的目的是将骨髓中的所有造血细胞“清空”，使残留的正常造血细胞在骨髓中重建造血，最后达到完全缓解（原始细胞5%）。年轻（1860岁）的成人AML患者，在接受标准化疗后完全缓解（CR）率可达75%80%。尽管目前有诸多临床试验选用不同的蒽环类药物如去甲氧柔红霉素（IDA），或加用大剂量阿糖胞苷（HD-Ara-C）/足叶乙甙（VP16），或单一使用大剂量HD-Ara-C来替代标准方案进行诱导治疗，试图进一步提高CR率，但大多数结果并不令人满意。即使一些临床试验在诱导治疗期间使用新型化疗药物或者加大化疗剂量后能显示出疗效改善、无病生存（DFS）率提高，疾病负荷降低，但总体生存（OS）率并没有显著提高。这些临床研究结果提示：在这一群体中，目前很难通过进一步加强化疗力度来改善总体疗效。儿童AML与成人AML一样，阿糖胞苷（Ara-C）和蒽环类药物也是诱导缓解治疗的主要药物，不同的是，通常加用第三种药物：VP-16或者6-巯基鸟嘌呤（6-TG）。这样的治疗方案已经可以使75%92%儿童AML患者达CR，进一步提高化疗强度可能会改善长期DFS，但不能提高CR率，甚至因毒性导致死亡而降低CR率。标准的诱导缓解方案治疗老年（60岁）AML患者，CR率只有38%62%，在高龄患者（80岁）CR率更低，仅为30%。老年患者CR率降低主要与疾病原发耐药危险性和因全血细胞减少而死亡的危险性增高有关，因为这些病人在诊断时往往存在预后差的细胞遗传学改变和差的一般状况（PS），或者在AML诊断前已患有骨髓增生异常综合征或其他骨髓增殖性疾病。在老年患者用更强烈的诱导缓解治疗方案反而不利，而需寻找新的治疗策略以提高CR率。在非APL的AML患者中，不管为哪一个年龄组患者，诱导缓解治疗失败的原因除了因毒副作用而死亡以外，主要为对多种化疗药物耐药（MDR）。膜P糖蛋白（P-gp）的过多表达是MDR的典型标志。P-gp属于磷脂的糖蛋白，其在细胞膜的功能为排出泵。在对化疗耐药的患者中，白血病细胞常伴有P-gp过多表达。在诱导缓解治疗方案中应用MDR调节剂（如环孢菌素A或其类似物PSC833）以克服化疗耐药而提高CR率是目前原发耐药患者治疗中的一个主要举措，遗憾的是迄今尚未在前瞻性比较研究中有可重复的成功疗效的结果。由于这些调节剂对化疗药物药代动力学的影响及它们自身的毒副作用，故实验组患者的化疗药物的剂量必须减少。剂量减少及早期毒性的增加均使任何可能获得的好处受到影响。APL是AML的一个特殊类型，临床上以原发纤溶亢进或弥漫性血管内凝血（DIC）等凝血异常为特征，早期死亡率高，在全反式维甲酸（ATRA）治疗本病以前，它被认为是预后最差的一种AML亚型。目前，ATRA+含蒽环类药物的化疗方案是APL诱导缓解治疗的标准方案，CR率高达90%以上。诱导缓解治疗失败的主要原因是致死性的出血、感染和维甲酸综合征（RAS），而不是原发耐药（1%），似乎已没有空间来进一步提高CR率。（二）缓解后的细胞毒治疗难以清除白血病微小残留病灶目前，AML患者CR后有3种治疗选择：在短期（46个月）内进行23个疗程的化疗；自身造血干/祖细胞移植（Auto-HSCT）；异基因造血干/祖细胞移植（Allo-HSCT）。这些治疗措施的目的均为了最大程度减少或根治白血病微小残留病灶（MRD），以减少复发率，达到长期生存或治愈。在年轻的成人AML患者，最常见的是给予比诱导缓解治疗更强烈的化疗方案（如HD-Ara-C）进行23个疗程化疗，低危组（根据细胞遗传学分层）AML，复发率（RI）25%，4年OS率70%，中危组分别为50%和40%50%，高危组分别为70%和20%。大宗III期临床研究资料显示，总体上年轻AML患者的4年OS率为30%40%。对于年老患者任何力度的细胞毒巩固治疗的疗效均不理想，不到20%患者能持续缓解，仅约10%患者长期无病生存。儿童AML的缓解后治疗基本上与年轻成人AML的一样，应用单一中剂量或大剂量Ara-C治疗，但更多的是与L-门冬酰胺酶、米托蒽醌、氨丫啶或依托泊苷联合治疗。少有比较儿童AML不同的缓解后治疗的随机化试验结果报道，最近，英国MRC研究组已完成了一项随机化临床试验（AML-12），结果显示2个疗程的缓解后治疗与3个疗程的治疗效果相同，总体上，复发率为1/3，长期OS率可达50%。目前认为非APL的AML患者不需维持治疗，因为维持治疗不能降低RI，甚至有学者认为维持治疗反而会影响疾病复发后挽救性治疗的成功率，对总体生存不利。相反，对于巩固治疗后PML-RAR持续阴性的APL患者，普遍认为间歇性ATRA与小剂量化疗（6-MP+氨甲喋呤）联合维持治疗2年可以减少RI，但是，即使这样，仍然有15%20%APL患者最终复发。造血干细胞移植虽然是目前清除MRD最有效的手段，但受年龄、供者和副作用等限制，仅适用于部分患者，复发仍然存在，仅少部分患者可能治愈。（三）存在白血病干细胞如上所述，目前的细胞毒化学药物治疗AML策略能很大程度的减少大部分患者的肿瘤负荷，从而达到临床缓解，但是，即使加大细胞毒化疗的力度如Auto-HSCT，也难以克服MRD，因此，大多数病人最终必然疾病复发而死亡。近20多年来，随着支持治疗的不断改善和细胞毒化疗力度的加大以及一些新的细胞毒药物的应用，AML患者的长期生存率虽有所改善，但大部分病人仍然是不可治愈的。Allo-HSCT成功治疗AML的机制主要为移植物抗白血病（GVL）作用而非细胞毒作用。这些化疗药物缺乏持久的疗效提示它们通常只能去除增殖快的白血病原始细胞，无法有效清除白血病干细胞（LSC）群。越来越多的研究表明，AML存在LSC，它的免疫表型为CD34+、CD38-、CD71-、HLA-DR-、CD90-、CD117-和CD123+。LSC与正常HSC免疫表型的区别在于两者不同表达CD90、CD117和CD123。AML的LSC不仅来源于正常的HSC，而且还可来源于正常的造血祖细胞。HSC和祖细胞在转化为LSC的过程中是通过不同的基因突变而发生的。HSC本身就具有自我更新的能力，因此，在HSC细胞群中初始的突变就不太可能会与自我更新有关，而在存活或分化通路上有可能发生变化。与此相反，祖细胞不具备明显的自我更新的潜能，初始的突变则倾向于增加其自我更新的能力。这就提示了分别源自HSC和髓系祖细胞的LSC将具有不同的生物学特性，因此对于不同的治疗手段也将有不同的反应和疗效。但是，对于发生在干细胞或祖细胞水平上的不同突变之间的相互作用的了解还不清楚。有证据提示，突变可以导致细胞异常的自我更新从而引起发病，然而，对于LSC在生存、凋亡和分化等过程中的其它变化是否有同样作用尚没有得到明确证实。最近的研究已明确了有关LSC特异的发育、细胞和分子的特征。研究证实，源自人类AML不同FAB亚型的LSC具有自我更新的能力。此外，最近有报道根据在体内各自发育潜能和自我更新的相对能力水平不同，进一步阐述了AML的不同LSC亚类特点。这些研究证实，LSC不仅保持了正常干细胞的重要特征，而且在生物学上又有别于大量无法自我更新的白血病原始细胞。另一方面，对LSC细胞周期的研究发现，AML的LSC总体上都处于静止期。这也就使得这一恶性细胞群对于常规的化疗药物耐药，或者至少是与正常HSC相比对常规化疗更不敏感。这些相对静止的LSC也许就是复发的一个主要因素。人类AML的LSC还有一些独有的分子学特征，例如干扰素调节因子1（IRF-1）和死亡相关蛋白激酶1（DAP激酶1）的基因表达水平上调，NF-B的活性持续高水平。NF-B介导细胞生存，绝大多数化疗药物可以上调NF-B的活性， NF-B的高活性与细胞周期静止状态之间的密切联系可能是导致LSC对常规化疗药物耐药的重要原因。（四）发病机制复杂目前，AML发病的分子机制研究已取得了很大的进展，研究表明它是一种基因型和表型复杂的疾病。AML基因型的多样性增加了治疗难度。与其他人类肿瘤一样，AML不只是一种突变最终产生的结果。流行病学和遗传学的资料显示，许多AML细胞都会反复发生多种突变，无论是点突变还是基因重组和/或染色体易位。来自于白血病动物模型的实验资料同样也支持疾病的多步骤发病机制。根据人类急性白血病发生的突变图谱分析，疾病相关的等位基因可以粗略地被分为两组互补的基因群：一组可以赋予造血祖细胞增殖和/或生存优势；另一组削弱造血细胞的分化能力，造成分化障碍，从而赋予处于某一特定分化阶段的造血细胞自我更新的能力。AML突变基因中第一组互补的基因群赋予造血祖细胞增殖和/或生存优势，通常是信号转导通路异常激活后的结果。在髓系白血病中这样的例子包括RAS家族成员、受体酪氨酸激酶KIT和FLT3基因突变后激活，NF-1功能缺失，以及目前更为公认的造血磷酸化酶SHP-2突变后的功能获得。这些突变发生于50%左右AML病例，除个别情况外，对于某一特定患者只会有一种突变发生。这些突变可被看作一组互补的基因群，其中任一突变都足以赋予白血病细胞增殖和生存优势。在AML患者中，FLT3是经常发生突变的基因，近30%-35%的AML患者FLT3发生突变并被激活。20%-25%的AML病例中，FLT3的近膜区域有内部串联重复序列（ITD）出现，大小从几个到大于50个氨基酸不等。ITD存在的结果使得FLT3酪氨酸激酶在结构上被持续激活。FLT3近膜区域和催化区域的晶体结构显示近膜区域中有一个延伸段，其中由7个氨基酸构成的短链插入到活性袢中，由此推测这样的结构形式可以抑制激酶的活性。AML中ITD的突变只发生在这个由27个氨基酸组成的延伸段上，所以推测突变导致原有结构的改变，并最终导致酪氨酸激酶的激活。此外，大约5%-10%的AML患者FLT3的突变位置发生在活性袢，这样会导致激酶结构上持续被激活。这些突变发生在其他酪氨酸激酶上相似位置附近，则会导致蛋白的活性袢折叠打开，从而暴露了其ATP和底物的催化位点。在FLT3同一个等位基因上同时有ITD和活性袢发生突变的病例十分罕见。这种联合突变会过度激活该酶，并赋予这种细胞更多的增殖优势。大多数的研究显示，伴有FLT3突变的AML患者，无论是儿童还是成人，预后都很差。FLT3-ITDs可以激活好几条信号转导通路，从而赋予它增殖和/或生存优势。这些信号通路包括RAS/MAPK，STAT和PI3K/AKT。在一个小鼠骨髓移植实验中，经过大约45天的中位潜伏期，FLT3-ITDs可以诱导初期造血祖细胞，导致骨髓增殖性疾病（MPD）发生。这些动物并没有发生AML，但是它们都出现相当程度的白细胞增多，而且其中髓系细胞发育成熟和分化正常，以及由于髓外造血而导致脾脏肿大。这些结果提示，对于初期小鼠的造血祖细胞，单是FLT3-ITDs不足以诱导AML的表型出现。此外，FLT3-ITD诱导的MPD无法移植给次级受体小鼠。这些资料或者提示突变的FLT3-ITD无法赋予细胞特定的自我更新的特性。FLT3-ITD的表型类似于其它酪氨酸激酶如BCR-ABL，TEL-PDGFR，TEL-ABL或者TEL-JAK2，它们在人体中通常会引起骨髓增生。综上所述，酪氨酸激酶结构上的激活虽然足以诱导骨髓增生，但并不能导致AML发生。因此，激活的酪氨酸激酶要能够直接导致白血病发生，似乎还需要与其它突变共同作用，才会使得造血细胞具有自我更新的能力。AML中第二个互补的基因组基本上包括转录因子或者是转录共激活物，它们对于正常的造血细胞发育、分化是至关重要的。AML中的染色体易位经常会累及到对正常造血细胞发育十分重要的转录因子或是转录共激活物。已知急性白血病中有许多染色体易位都影响到核结合因子（CBF）。其中，研究最广泛的就是RUNX1-ETO、CBF-SMMHC和RUNX1。转录因子CBF是一个由RUNX1（即AML1）和CBF两个亚单位构成的异二聚体。无论是RUNX1还是CBF的纯合子都会导致其功能的完全丢失，最终会引起基因工程小鼠体内定向造血功能的完全缺如。这说明CBF中的两个组成成分对于造血系统的分化都是不可缺少的，获得性的基因重排或基因突变会导致CBF的功能缺失，从而影响造血系统的分化。事实上，许多利用不同细胞系而获得的实验证据均提示，那些与白血病相关的融合蛋白都表现为对CBF的显性负作用。他们通过异常地募集包括组蛋白去乙酰化酶在内的共抑制复合物来抑制CBF的靶基因的活性，而不是激活它们。在某些具有白血病易患性的白血病家族中，CBF功能的丢失在其发病机制中亦起着重要作用。例如，家族性血小板异常伴AML倾向（FPD/AML综合征）是一种常染色体显性遗传病，它就是由于基因RUNX1单倍剂量不足引起的。虽然此类患者的生殖细胞携带有RUNX1基因突变，但是在一开始他们并不发病，而是在出生以后，其骨髓细胞出现细胞遗传学上的异常，即获得所谓二次突变时，才会发生白血病。此外，在散发的白血病患者中，由于点突变而导致RUNX1功能缺失者大约占3%-5%，其中大多数都是因为影响了RUNX1与DNA结合的能力。这些AML患者中，许多都是因为RUNX1两个等位基因都完全丧失功能，提示这样基因功能缺失的纯合子对疾病的进展和严重程度有影响。虽然突变和基因重排使CBF的功能受累在AML发病机制中发挥着重要的作用，但这些改变并不能直接导致AML的发生。在实验动物中，成熟的造血祖细胞中RUNX1-ETO的表达无法诱导AML发生，只有在使用化学诱变剂或者是感染有复制能力的逆转录病毒，插入基因组不同位点而引起二次突变后才会导致AML发生，即“二次打击（two hits）学说”。APL总是伴有染色体的易位，通常累及到位于17号染色体上的维甲酸受体（RAR）及其5个不同伙伴基因中的一个。每一种APL的特征都是出现分化障碍，造血细胞的发育都停滞于早幼粒细胞阶段。目前研究最广泛的且在APL患者中最常出现的，就是伴有t(15;17)的融合基因PML-RAR.。PML-RAR表现为对RAR的显性负作用，它通过募集共抑制复合物来抑制维甲酸靶基因的表达，而非刺激其表达。这种方式有些类似于RUNX1-ETO、CBF-MYH11和ETV6-RUNX1。PML-RAR.的表达常伴有分化障碍和细胞自我更新的增加。像RUNX1-ETO一样，单纯PML-RAR或RAR-PML的表达并不足以导致AML。小鼠动物模型显示，二次突变是APL发病机制中不可缺少的。此外， APL患者基因型分析结果也支持APL的发病需要不只一种突变。至少30%的APL患者除了存在PML-RAR融合基因以外，还有FLT3-ITD突变。在正常个体中并未发现这些突变。因此，这些互相印证的事实提示，至少在APL的部分患者中，这两种突变都是致病所需的。在AML伴有染色体易位的患者中，已明确的其它转录因子和转录共激活物包括转录因子HOX家族（它被发现在十几种染色体易位中受到累及）、MLL基因（超过四十几种不同的染色体易位累及到它）、CBP、p300、MOX和TIF2等基因。此外，越来越多的证据表明，就象RUNX1，其他一些转录因子，如GATA-1，C/EBP和PU.1等，发生点突变后造成功能缺失，在白血病的发病机制中也起着十分重要的作用。二、临床表现及辅助检查（一）临床表现1.贫血 是起病时最常见的症状之一，可表现为疲乏无力、面色苍白，并在短期内进行性加剧，伴活动后头昏眼花、胸闷气急、心慌或心悸等。2.出血 也是起病时最常见的症状之一，常表现为皮肤瘀点、瘀斑，鼻衄，牙龈出血或月经过多等，血小板减少是大多数病人出现这些症状和体征的原因，部分患者尤其APL患者可伴DIC或原发性纤维蛋白溶解亢进，此时可表现皮肤大片瘀斑甚至血肿，针刺部位或伤口迟发性渗血不止。血小板严重减少或伴有凝血功能障碍的病人起病时尚可表现内脏出血如血尿、消化道出血、眼底出血及颅内出血等。3.感染症状 畏寒、发热和多汗是患者继发性感染常见的首发症状。常见的感染灶有牙龈炎、口腔溃疡、咽峡炎、上呼吸道感染或肺炎以及肛周炎或肛周脓肿等。当粒细胞缺乏时感染灶可以不明显，但往往伴有高热，提示可能发生了菌血症或败血症。严重感染的患者可表现为感染性休克。4.髓外浸润症状（1）淋巴结、肝、脾肿大 淋巴结肿大多数为全身性，少数为局部淋巴结肿大，常为轻至中度肿大，触之不痛而饱满，质地中等，与周围组织无粘连。肝、脾也常为轻至中度肿大，无触痛，在M4、M5患者相对多见。儿童患者的肝脾肿大程度一般比成人更显著。（2）骨和关节疼痛 胸骨体下端压痛是常见的体征，往往具有诊断意义，起病时其他部位尤其长骨的干骺端感觉疼痛或压痛也不少见。关节痛大多固定在一个或几个关节，但也可以是游走性的，这种情况在儿童患者尤其多见，初诊时常误诊为风湿病。（3）牙龈和皮肤浸润 白血病细胞浸润牙龈和皮肤可见于各型AML，其中以M5和M4型为最多见。牙龈受累时可表现为牙龈肥大肿胀，覆盖于牙齿上，不红且无痛，与牙周炎有别；受累皮肤表现为真皮结节（cuitis），常为多发或遍及全身皮肤，少数病人的病损可为散发，往往高出皮肤表面，通常为粉红色，与小的丘疹相似，一般无瘙痒症状。真皮结节偶尔发生在骨髓或其他组织白血病细胞浸润之前，也可为病情复发的首发症状。（4）眼部浸润 眼部浸润一般发生于原始细胞极度升高（200109/L）的患者，以视网膜浸润为主，眼底出血也较多见。眼底镜检查可见一个或多个罗特斑点，周围伴明显出血。其他部位病变也不少见，如玻璃体和脉络膜出血及中心静脉阻塞等。（5）中枢神经系统浸润 中枢神经系统白血病细胞浸润即中枢神经系统白血病（CNS-L），其临床表现多种多样，但最早最常见的症状是持续的头痛、头晕和烦躁等；当脑膜浸润为主时，与脑膜炎的症状相似，严重时可表现为典型的颅内压增高症如剧烈头疼、喷射性呕吐、颈项强直和视乳头水肿等；颅神经受累时可导致面瘫、视力障碍、瞳孔改变、听力下降和眩晕等；脑实质浸润时可有精神症状如定向力障碍和脑瘤样定位体征；脊髓浸润可出现神经根痛、截瘫及大小便障碍等。CNS-L多见于外周血白细胞40109/L的患者中，尤其以M5和M4多见。事实上，AML患者以CNS-L为首发症状者少见，常为髓外复发的首发表现，近年来，APL患者CNS复发日益受到重视。（6）绿色瘤 为髓系细胞的实体肿瘤，又称粒细胞肉瘤，是由成堆的急性粒细胞白血病细胞形成的结节或小肿块。它可以是AML病人初治和复发时的首发体征，多见于伴t（8；21）或t（9；22）的AML病人，在AML病人发生率为3%7%，儿童较成人常见。绿色瘤可发生在多种部位，包括皮肤、软组织、骨膜、骨（颅骨、眼眶等）、脊髓膜、脑、淋巴结、鼻旁窦、乳腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、胃肠道、肺和纵隔等，触之坚硬，压之不痛。有时组织学诊断比较困难，需与大细胞淋巴瘤、浆细胞瘤和嗜酸性肉芽肿等相鉴别。一旦疑及本征，在进行病理切片检查同时，必须行肿块的印片瑞氏染色检查，如发现嗜天青颗粒或奥氏小体即可确诊，有时需进行MPO和其他髓系抗原的免疫细胞化学检查，以确定是否为髓系来源。（7）其他器官的浸润 白血病细胞还可以浸润肾、肺、胸膜、心脏、心包和胃肠道等多种脏器而引起多种多样的临床表现，但这些脏器的浸润很少于发病初期就出现相应的症状和体征。（二）辅助检查1.外周血象 白细胞总数升高、正常和减少的患者约各占1/3，约85%患者白细胞分类可以发现白血病细胞。白细胞明显升高多见于AML-M4或AML-M5型，部分病人可超过100109/L，即高白细胞血症，常伴有CNS-L或肺浸润，预后较差。白细胞减少多见于APL，部分患者的白细胞可1109/L。大部分患者外周血白细胞分类可发现原始和幼稚淋巴细胞，而嗜中性粒细胞比例则明显减少。大多数患者起病时红细胞和血红蛋白均有不同程度的减少，并且进展较为迅速，多表现为正细胞正色素性贫血。红细胞可有轻度大小不等和异形，网织红细胞计数可以轻度升高，在少数病人尚可出现幼红细胞，尤其见于AML-M6。绝大多数病人的血小板计数均有不同程度的减少，严重者初诊时血小板2109/L，极少数病人早期可能正常，但不久就会减少。2.骨髓象 骨髓液涂片检查是诊断AML必备的手段。大部分患者的骨髓象呈增生显著活跃或极度活跃，骨髓中经常充满着白血病性原始或早期幼稚细胞，在去红细胞系的有核细胞计数中最少占30%。部分病人因存在大量白血病细胞，骨穿时骨髓呈干抽或骨髓液容易凝固。白血病细胞与相对应的正常细胞比较往往有形态的异常，表现为胞体较大，可有大小不均现象，核浆比例增大，核、浆发育不平衡，核染色质呈细网状，核仁常多见而明显，有丝分裂象多见，可见对镜细胞及其他各种畸形细胞。正常的骨髓细胞显著减少，包括比早幼粒细胞更成熟的各阶段粒系细胞、正常红系细胞和巨核细胞。部分病人骨髓象呈增生低下，甚至与稀释性骨髓象相似，多见于老年患者。这类病人的骨髓涂片中不易找到白血病细胞，容易与再生障碍性贫血（AA）及骨髓增生异常综合征（MDS）等疾病相混淆，需进一步行骨髓活检物滚片染色检查和病理学检查加以鉴别。此外，少数病人可伴有骨髓纤维化，也需结合骨髓活检滚片或病理学检查而确诊。3.骨髓病理 大部分患者的骨髓病理学检查显示，正常三系造血细胞混杂分布的图象消失，结构脂肪消失，代之以大量的原始或/和早期的幼稚细胞几乎占据整个骨髓腔。部分患者的骨髓病理图象中可见到残留的正常造血成分，其中多为中幼粒细胞、嗜酸性粒细胞和幼红细胞，并伴有异常原始细胞不均匀的浸润，这些改变多见于由MDS转化而来的AML。少部分患者中可见结构脂肪占绝大部分骨髓腔，在结构脂肪的间隙散在造血细胞，并可见多量的异常原始细胞，如果不仔细观察容易误诊为AA，这种情况多见于低增生型MDS转变而来的急性白血病及老年患者。因此，在AML诊断中，当骨髓穿刺涂片检查失败的时候，骨髓活检病理学检查是一个不可缺少的补充手段。此外，与骨髓涂片检查比较，骨髓病理检查对骨髓增生程度的判断更为客观可靠，并且尚能反映是否存在骨髓纤维化及其程度。4.细胞形态学和组织化学染色检查 细胞形态学检查是诊断AML最基本的手段，由于在诊断中异常原始细胞和幼稚细胞的比例是诊断的关键，因此首先必须在形态学上认识这些细胞。现将国内、外学者普遍认同的各种AML细胞的形态特点分别描述如下。（1）原始细胞（粒细胞或单核细胞）型 原始细胞核/浆比例高，核染色质细致，有一个或多个明显的核仁，细胞浆不成熟并且不含颗粒。（2）原始细胞（粒细胞或单核细胞）型 与原始细胞型相似，胞浆量较少，含少量细小颗粒，不含粗大颗粒。（3）异常的早幼粒细胞 胞形常呈椭圆形，核偏于一侧，另一端胞浆中有异常颗粒，这些颗粒有的粗大，可覆盖细胞核，有的较细。并且，胞浆中常伴有Auer小体，有时甚至多如柴捆。（4）异常的中性中幼粒细胞 核浆发育显著不平衡，胞浆呈桔黄色或偏碱，胞核有12个大核仁。（5）异常中性晚幼粒细胞 胞浆中有中性粒细胞，可有空泡，核可有凹陷，在核凹陷处有一淡染区，更重要的是仍可见核仁。（6）异常的嗜酸性粒细胞 胞浆中除有典型的嗜酸性颗粒外，还有大的不成熟嗜碱颗粒，并可存在不分叶的核。（7）异常的幼稚单核细胞 幼单细胞核扭曲或折叠，胞浆呈灰蓝色，散在嗜天青颗粒。（8）异常的原始巨核细胞 细胞形态多样，胞体可非常小，伴致密的核染色质，也可有较大的胞体伴致密的网状核染色质及13个明显的核仁，胞浆可见气泡。光镜下可有淋巴样小巨核细胞、单圆核巨核细胞、多圆核巨核细胞、大单圆核巨核细胞、多分叶巨核细胞等。（9）异常的幼稚红细胞 细胞巨幼样变，双核或多核。单凭细胞形态学能对大部分AML病例作出诊断，但其分型诊断在大多数情况下需要结合组织化学染色检查。各亚型AML的组织化学染色特征如表1所示，表中除NAP染色的靶细胞为成熟的嗜中性粒细胞外，其他染色的靶细胞均为原始或幼稚的白血病细胞，但M6为幼红细胞的显色结果。表1 AML组织化学染色特征M1M2M3M4M5M6M7POX+2+3+4+-2+-+-SB+2+3+4+-2+-+-AS-DCE+2+3+4+-2+-+-AS-DAE +NaF-+不抑制+不抑制+3+不抑制+3+部分抑制2+3+被抑制-PAS-+弥漫-+弥漫+3+弥漫-2+细颗粒-2+细颗粒3+颗粒或弥漫-+NAP低低低低或正常低或正常低低ACP-+-+2+2+2+-+POX：过氧化物酶染色；SB：苏丹黑染色；AS-DCE：氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色；AS-DAE：醋酸AS-D萘酚酯酶染色；+NaF：氟化钠抑制试验；PAS：过碘酸-席夫反应，又称糖原染色；NAP：中性粒细胞内碱性磷酸酶染色（积分）；ACP：酸性磷酸酶染色；弥漫：指阳性细胞染成弥漫性红色；细颗粒：指阳性细胞染成细颗粒状红色。5.细胞免疫表型检查 已成为现代白血病诊断中的重要手段之一，在急性白血病各亚型之间及其与相关疾病之间的鉴别诊断中具有重要的应用价值，对急性白血病的预后估计和治疗方案的选择也有一定的指导意义。目前常用的检测方法有流式细胞术法和免疫组织化学染色法。前者检测速度快，检测的细胞多，并且当被测标本中白血病细胞比例高而开窗准确时，所得结果客观可靠，此外，还可以对同一细胞同时检测多种表型。后者在骨髓或血涂片上或未固定的病理切片上结合形态学观察白血病细胞的免疫组化染色情况，因此结果能直接反映白血病细胞的表型，应用于白血病细胞比例不高的标本检测较为适合，但与前者比较相对速度较慢，被测的细胞较少，并且具有主观性，对操作者的要求较高。一般认为阳性的标准是，20%或以上的白血病细胞表达被测抗原。根据白血病细胞免疫表型分析，可以确定急性白血病细胞来源的系列，各系列的相对特异的抗原标记如表2 所示，分数越高表明特异性越强，反之也然。表2 各系列细胞抗原标志的特异性分数分数B细胞系T细胞系粒-单细胞系红细胞系巨核细胞系2cCD22mCD22CD79asIgccCD3mCD3TCR/TCR/MPOcCD13血型蛋白AHbFRhDCD41aCD41bCD42CD42cCD61F1CD19CD20CD2CD5CD8 mCD13CD33CD36（弱）CD65 CD68CD36（强）ABHCD36（强）ABH0.5CD24CD10TdTCD7 CD1a CD4CD11b/cCD14 CD15 CD64CD1176.细胞和分子遗传学检查 大部分初治AML有染色体异常，其中一些染色体异常的白血病具有独特的形态学、免疫表型和临床特征，AML-M3是一个典型的例子。染色体异常可以导致一些癌基因的突变或放大及一些特征性的融合基因形成，这些基因及其编码的蛋白质的检测对白血病的诊断、残留病灶的监护、治疗、发病机制的研究和预后估计都具有重要的价值。染色体异常包括数量和结构的异常。染色体数量异常预示白血病细胞克隆的演变，多见于疾病进展或复发时。在染色体异常的AML病例中，约15%20%为数量异常，除性染色体外，其他染色体的增多或减少往往不会独立存在，常伴有其他染色体的结构异常，常见的有+8、-7、+4、-5、+19、-Y等，此外还有报道+9、+21、+22、+13、+11和-X等。AML患者常见的染色体结构异常及其受累的基因如表3 示。表3 AML常见的染色体结构异常及其受累基因染色体结构异常受累基因t（1；11）（p32；q23）t（3；3）（q21；q26）t（3；21）（q26；q22）inv（3）（q21q26）del（5q）t（6；9）（p32；q34）t（6；11）（q22；q23）t（8；21）（q22；q22）t（9；11）（p22；q23）t（11；17）（q23；q22）t（9；22）（q34；q11）t（11；19）（q23；p13）t（15；17）（q22；q11-21）t（16；21）（p11；q22）inv（16）（p13q22）AF-1；HRX？；EVI-1EVI-1；AML-1？；EVI-1IRF-1DEK；CANAF-6；ALL-1ETO；AML-1AF-9；HRXPLZF；RARABL；BCRHRX；ENLPML；RARTLS；ERGMYH-11；CBFB7.电镜检查 可观察细胞的超微结构，从而解决一些常规方法难以解决的诊断问题，提高急性白血病形态学分类的准确性。AML-M0、AML-M5、ALL和AML-M7的原始细胞相互间的鉴别在光镜下有时可能很困难，而电镜细胞化学染色有助明确诊断。目前有髓过氧化物酶（MPO）和血小板过氧化物酶（PPO）等电镜细胞化学染色。其优点是灵敏度高，特异性强，能揭示白血病细胞发生早期部分分化的特征。AML的原始粒细胞对MPO呈强阳性反应，AML-M5的原始细胞呈弱阳性反应，部分细胞阴性，ALL和AML-7的原始细胞呈阴性。AML-M7细胞对PPO呈阳性反应，而AML-M1M6和ALL的原始细胞均阴性。三、诊断AML患者起病急，大部分患者在初诊时或多或少地有出血、感染发热、贫血和骨、关节疼痛等中的一种或以上症状和体征，如果同时存在肝、脾或/和淋巴结肿大，就更要疑及本病，此时，外周血象检查是不可缺少的，若外周血象异常包括三系细胞中的一系或以上的减少、白细胞明显升高或/和出现原始及幼稚细胞等，则必须进行骨髓细胞学检查以明确诊断，有时，即使外周血象正常也要进行骨髓细胞学检查。少数患者以其他髓外浸润引起的症状如皮肤结节、颅内高压或胸腔积液等为主要表现而就诊，可行相应的有关检查如局部结节或肿块的穿刺细胞学检查或活检、脑脊液或胸腔液细胞学检查，若发现原始或/和幼稚血细胞，进一步骨髓细胞学检查以了解骨髓内情况。此外，极少数患者因体检发现外周血异常进一步骨髓细胞学检查而诊断为AML。总之，AML患者起病方式多种多样，上述的各种症状、体征及外周血象的改变是AML患者较为常见的初诊时表现，但大多数为非特异性，当难以用其他常见原因或疾病解释时，为疑诊本病的重要线索，而明确诊断依赖于骨髓细胞学检查。骨髓穿刺失败、骨髓增生低下尤其重度低下时，必须进行骨髓活检滚片染色检查及病理学检查以明确诊断。一旦AML诊断明确，尚需分型诊断。目前AML分型诊断要求在FAB的形态学分型诊断基础上，深入了解各种亚型的免疫学表型、细胞遗传学和分子生物学的改变，因此，有条件的单位已对高度怀疑本病的患者在抽取骨髓液或/外周血进行细胞形态学检查的同时，进行白血病细胞的免疫表型分析、核型分析以及一些标志性的融合基因检查。对于难以分型诊断的病例有时还需要送电镜检查加以区别。（一）诊断标准诊断AML除临床症状、体征和血象外，骨髓细胞形态学检查是诊断的主要依据。从1976年起FAB协作组提出以骨髓原始细胞30%为急性白血病的诊断标准以后，国际上均统一采用此标准。我国学者参照FAB的分型标准略作修改提出了目前全国统一的如表4所示AML形态学分型及其诊断标准。在这一AML分型诊断标准中，应用了FAB协作组于1985年关于AML分类修订标准提出的两个概念，即全部骨髓有核细胞（BM-ANC）计数中的原始细胞百分比和非红系细胞（NEC）计数中的原始细胞百分比。其中原始细胞包括型和型原始细胞。NEC是指除外浆细胞、淋巴细胞、组织嗜碱细胞、巨噬细胞及所有有核红系细胞的骨髓有核细胞。在总体上，除了AML-M6以外，AML的诊断标准为原始细胞30% BM-ANC。在诊断AML-M6时，原始及幼稚红细胞需要50%BM-ANC，并且，原始细胞30% NEC。但是，在实际临床实践中，单独凭原始细胞30% BM-ANC这一标准，诊断一些AML亚型仍可能有误差。因此，如表4所示，在诊断AML-M2b和AML-M3时，分别以异常中性中幼粒细胞和异常早幼粒细胞比例为主要依据，而原始粒细胞比例不一定30%；在诊断AML-M4、M5时，需要将幼稚单核细胞与原始细胞一起计算作为诊断依据。表4 AML形态学分型及其诊断标准形态学分型诊断标准急性粒细胞白血病未分化型（M1）原粒细胞90%，早幼粒细胞很少，中幼粒以下阶段不见或罕见急性粒细胞白血病部分分化型（M2） M2a M2b原粒细胞为30%90%，单核细胞20%，早幼粒细胞及以下阶段10%原粒细胞、早幼粒细胞和异常中性中幼粒细胞均明显增多，以后者为主，并且后者30%急性早幼粒细胞白血病（M3） M3a M3b异常早幼粒细胞30%嗜苯胺蓝颗粒粗大，密集甚至融合嗜苯胺蓝颗粒密集而细小急性粒-单核细胞白血病（M4） M4a M4b M4c M4Eo原始和早幼粒细胞增生为主，原、幼单核细胞20%原、幼单核细胞增生为主，原始和早幼粒细胞20%既具粒细胞系又具单核细胞系特征的原始细胞30%除上述特征外，异常嗜酸性粒细胞占5%30%急性单核细胞白血病（M5） M5a M5b原单核细胞80%原始和幼稚单核细胞30%，原单核细胞80%急性红白血病（M6）骨髓中红系有核细胞50% BM-ANC，且有形态异常，原粒细胞或原+幼单核细胞30%；若血片中原粒细胞或原单核细胞5%，骨髓中原粒细胞或原+幼单核细胞20%急性巨核细胞白血病（M7）外周血有原巨核细胞；骨髓中原巨核细胞30%；骨髓病理有原巨核细胞增多，网状纤维增加注：表中的各种细胞百分比除了特殊说明外，均指NEC计数百分比。（二）分类近20年来，随着免疫学和细胞及分子遗传学技术的发展和不断应用，对AML异质性的研究更加深入，AML的精细分类势在必行，对本病的预后估计和治疗选择均具有重要意义。但是，目前AML的分类仍然主要依靠细胞形态学和细胞化学染色来区分，将其分为表4 所示的AML-M17七个亚型。根据这一分类系统，可以对大部分AML病例进行归类，但不能识别少部分AML病例。急性白血病的免疫学分型一般分为二个阶段，首先，根据白血病细胞表达的系列相关抗原确定其系列来源，然后，根据白血病细胞表达的各系列分化期相关的抗原进一步分型。结合白血病细胞免疫表型分析检查，目前已普遍认为存在一个AML新的亚型即急性髓细胞白血病微分化型（AML-M0），这些病例的白血病细胞形态学上呈原始细胞特征，且与ALL-L2型细胞相似，细胞化学POX及SB染色3%细胞阳性，在过去往往诊断为ALL，实际上，白血病细胞的表型为髓系抗原如CD33或/和CD13阳性，MPO阳性，而淋系抗原阴性。此外，另一些形态学上难以确认的病例经免疫表型分析显示巨核细胞系抗原如CD41、CD42或CD61等阳性而确诊为AML-M7。许多学者提出了白血病细胞系列相关抗原的特异性积分方法，根据Garand等提出的积分方法，可将AML分为如表5 所示的四大免疫学类型。表5 AML的免疫学系列分型诊断标准免疫学分型FAB分型系列积分B系T系粒单系巨核系红系1单表型 AMLAML-M0M500200 AMLAML-M600222 AMLAML-M7002222单表型为主Ly+AMLAML-M0M522222Ly+AMLAML-M622222Ly+AMLAML-M7222223混合型HALAML-M0M720M0M52 M72M62HALAML-M0M702M0M52M72M624未分化型AULALL-L1、L222222随着对急性白血病的深入认识，目前已经发现急性白血病FAB形态学分类的各亚型中除了个别类型的生物学特征具有相对均一性如AML-M3外，而大多数类型具有高度的异质性，尤其在对治疗的反应性和预后等方面，在患同一亚型的急性白血病的不同个体对相同治疗方案的疗效反应也不完全一致，预后也不一样。相反，具有相同的特殊细胞和分子遗传学异常的病人，其白血病细胞的形态、免疫表型和治疗反应性及预后较为一致，即使白血病细胞的形态和免疫表型等方面不一致，其预后也相似。鉴于上述认识，WHO的最新分类将一些具有特殊细胞和分子遗传学改变的急性白血病重新归类，同时结合形态学和细胞免疫学将AML如表6分类。在AML的分类中WHO分类还特别将伴有多系病态造血或与治疗相关的急性白血病分别归类，而将其他无特殊细胞和分子遗传学异常的AML均归于“未特指型AML”，并将这一类型基本上按FAB形态分型进一步分为多种亚型。总之，WHO分型强调，细胞和分子生物学的异常从根本上决定了急性白血病病人对治疗的反应性和预后，这样的分型一方面有利于预后估计，更重要的是，能指导选择有效的治疗方案尤其分子靶向治疗，从而提高治愈率。表6 AML的WHO分型类型名称伴有重现性遗传学异常AML AML伴t（8；21）（q22；q22），AML1（CBF）/ETO AML伴t（15；17）（q22；q11-12）及其变异型，PML/RAR AML伴inv（16）（p13q22）或t（16；16）（p13；q22），CBF/MYH11 AML伴11q23 （MLL）异常伴有多系病态造血AML 原先有MDS或MDS/MPD 原先无MDS或MDS/MPD治疗相关性AML 烷化剂相关 拓扑异构酶抑制剂相关 其他药物相关未特指型AML AML微小分化型 AML未成熟型 AML成熟型 急性粒单细胞性白血病 急性单核细胞白血病 急性红白血病 急性巨核细胞性白血病 急性嗜碱性粒细胞白血病 急性全髓增殖症伴骨髓纤维化 髓细胞肉瘤（三）鉴别诊断1. 粒细胞缺乏症 本病起病急，常表现为畏寒、高热、全身骨骼酸痛、咽峡溃疡、上呼吸道感染或肺炎甚至败血症，外周血粒细胞严重减少，淋巴细胞比例相对增高，与一些AML患者起病时的表现非常相似，但前者往往有服用解热镇痛药等明显的诱因，多无明显的贫血和出血的症状，外周血淋巴细胞绝对计数并不升高且形态正常，血红蛋白和血小板多在正常范围，而以感染发热伴粒细胞明显减少的AML患者一般无导致粒细胞减少的明显诱因，常或多或少地伴有出血或/和贫血的症状，因此两者一般不难鉴别，如果有胸骨压痛则更倾向于AML的诊断，但明确的鉴别必须行骨髓细胞学检查，粒细胞缺乏症表现为粒系再生障碍或明显的成熟障碍，但形态正常，并且红、巨两系造血正常，而AML常表现为骨髓增生显著或极度活跃，以大量的白血病细胞增生为主，正常三系造血均明显受抑制。值得注意的是，粒细胞缺乏症病人恢复早期的骨髓象中早幼粒细胞或幼单核细胞和单核细胞可以明显升高，初一看与AML-M3或M4病人的骨髓象相似，但AML-M3病人的早幼粒细胞多有异常的嗜苯胺蓝颗粒或存在奥氏小体，借此可对两者作出鉴别，如果在形态学上难以鉴别，不能贸然诊断急性白血病而给予抗白血病治疗，可观察35天，粒细胞缺乏者可见外周血粒细胞逐渐恢复，骨髓象也逐渐恢复正常，同时病情日趋好转，而白血病患者的血象、骨髓象及病情则不会好转。此外，骨髓细胞或/和分子遗传学的检查也有助两者的鉴别。 2. 特发性血小板减少性紫癜 少数AML患者起病初期仅以皮肤粘膜出血和外周血血小板减少为突出表现，初诊时可被误诊为特发性血小板减少性紫癜，值得注意。如果仔细地体检，对于前者可能还会发现淋巴结、肝脾肿大或胸骨压痛等体征，然后进行骨髓细胞学检查即可做出明确的鉴别诊断。3. 急性再生障碍性贫血 起病急、感染发热、贫血、出血和外周血三系细胞进行性减少是急性再生障碍性贫血患者与一些AML患者共同临床特点，初诊时两者容易混淆，如果发现淋巴结或肝脾肿大、胸骨压痛或外周血涂片有原始或幼稚细胞，则基本上排除了再障的诊断，大多数情况下借助骨髓细胞学检查即可对两者做出鉴别。但低增生性AML与再障患者的骨穿标本均容易稀释，前者的骨髓涂片中也不易发现有白血病细胞，因此很容易误诊。此时，必须进行骨髓活检取材病理学检查或同时滚片染色检查以提高白血病细胞的检出率而对两者进行鉴别。有时，骨髓细胞遗传学检查能对两者做出明确的鉴别，因为AML可有染色体的异常而再障一般没有染色体异常。4. 巨幼细胞性贫血 严重的巨幼细胞性贫血和AML-M6患者均可表现为外周血三系减少，骨髓红系细胞明显增生，粒/红比例倒置，伴血细胞巨幼样变，有时两者容易混淆。但巨幼细胞性贫血患者的红细胞呈典型巨幼红细胞的形态，大小较一致，且无或少有其他的病态造血，有核红细胞PAS反应阴性，原始或早期的幼稚细胞少见，对叶酸和维生素B12治疗有效，而AML-M6患者则相反。5. 类白血病反应 类白血病反应是指可以由多种原因引起外周血象暂时性发生白血病样血液学改变的一类疾病，表现为外周血白细胞总数显著增高（3050109/L）或出现幼稚、原始细胞伴