雷公藤甲素通过caspase依赖的线粒体途径诱导白血病细胞.docx

标题：雷公藤甲素诱导的caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖的细胞死亡通过介导在白血病细胞线粒体途径引言：雷公藤甲素诱导的caspase依赖的细胞凋亡通过线粒体介导的通路在白血病细胞雷公藤甲素，从分离出一种二萜中国herbTripterygium wilfordiiHook.f，表现出抗肿瘤活广泛一系列实体瘤。在这里，我们研究它的对白血病细胞和效果发现，在100纳米或更小，它有效诱导凋亡的各种白血病细胞系和原发性急性髓性白血病（AML）的原始细胞。然后，我们试图找出其作用机制。伴随着雷公藤甲素诱导caspasedependent细胞死亡显著降低XIAP水平。ForcedXIAP表达减弱triptolideinduced细胞死亡。雷公藤甲素也减少Mcl-1的，但不BCL-2和Bcl-XLlevels。 Bcl-2的过度抑制triptolideinduced凋亡。线粒体膜此外，雷公藤甲素引起的损耗潜力和细胞色素C释放。caspase-9的基因敲除细胞耐药，同时的caspase-8缺失细胞对雷公藤甲素敏感，暗示的关键性线粒体但没有死亡受体途径雷公藤甲素诱导的细胞凋亡。 雷公藤甲素也增强了细胞死亡诱导其他抗癌剂。总的来说，我们的 结果表明，雷公藤减小 XIAP和强效诱导caspasedependent凋亡通过线粒体途径介导在白血病细胞 低纳摩尔浓度。强效雷公藤甲素的体外抗白血病活性值得进一步研究这种化合物对白血病的治疗和其他恶性肿瘤。介绍：雷公藤Hook.f中，卫矛科的一员植物家族，已用于中国药世纪。雷公藤内酯醇，二萜类化合物，首次从植物和结构上的特点在1972年并已被用于治疗各种自身免疫疾病的并作为患者的器官和组织移植的免疫抑制剂。近日，雷公藤甲素所表现出具有抗肿瘤特性范围广泛的抑制生长和诱导细胞凋亡人肿瘤细胞。雷公藤也显示敏感细胞死亡诱导的各种试剂，如Apo2/Trail ，TNF- ，和不同的化疗药物。然而，尽管雷公藤甲素的公认有效的抗肿瘤活性，我们的知识就其作用机制仍是有限的。到目前为止，这是已知的只有雷公藤块TNF-介导的诱导的c- IAP1的和c - IAP2和NF的激活？ B，并且诱导caspase激活。急性髓性白血病（AML）是一个积极的血液恶性肿瘤。尽管在过去的30年大力度，限制已经取得了进展在治疗AML的。当前反洗钱的主要治疗方法是化疗，诱导细胞死亡主要是通过凋亡不论是由固有的线粒体或外源性死亡受体途径，这两者导致介caspase激活和细胞解体。的发展创新疗法和鉴定更有效的药物，因此，仍然是白血病研究的高度优先事项。由于其抗肿瘤特性，雷公藤有希望作为一个治疗白血病。然而，较雷公藤诱导的细胞凋亡中的U937细胞通过激活胱天蛋白酶-3和下调XIAP最近的报告等，而且它下调的Bcr- Abl的表达并诱导K562细胞凋亡，几乎没有工作一直做了阐明雷公藤内酯醇的活性和机制白血病。通过分子机制的理解调解雷公藤甲素的促凋亡活性，这将是可以更好地了解其抗白血病效应，并确定它是否是用于临床使用的候选者。另外，了解雷公藤甲素的分子靶点及机制行动将使我们能够设计出合理的联合药物治疗，更有效地消灭白血病细胞。中所描述的研究在这里，我们研究各种白血病细胞雷公藤甲素的影响系和原发性AML母细胞，并表明雷公藤内酯醇在低纳摩尔浓度有效诱导凋亡的各种白血病细胞系和原发性AML爆炸。我们还调查在白血病细胞雷公藤甲素诱导的细胞凋亡的机制。值得注意的是，这种药物的水溶性衍生物是在临床试验中在欧洲。细胞处理方法：对数生长期的细胞（0.2106/ml的）或单核细胞fromAML和正常骨髓样本（1106/ml的）与治疗不同浓度的雷公藤甲素（AlexisBiochemicals，圣迭戈，加利福尼亚州）24和48小时。 DMSO适量的用作控制。要阻止caspase活化或蛋白酶体降解，细胞预处理20 M + IDN-1965，一般的半胱天冬inhibitor22（由IDUN制药，加利福尼亚州圣迭戈kindlyprovided），或之前0.2 M + MG132，aproteasome抑制剂（Calbiochem公司，圣迭戈，加利福尼亚州），1小时雷公藤加入。对于联合治疗的研究，成倍增长从AML样本（1106/ml的细胞）（0.2106/ml的）或单核细胞与雷公藤甲素的浓度增加和治疗的所选化合物在恒定的比率为48小时。细胞死亡分析通过膜联蛋白V染色，如在“细胞生存力测定法”中描述细胞活力测定法：细胞活力台盼蓝染色法用XR确定细胞计数器（Beckman Coulter公司，富勒顿，加利福尼亚州）。细胞凋亡估计通过caspase-3的激活都Western blot分析和流式细胞仪磷脂酰serine23测量用膜联蛋白-V-FLUOS染色试剂盒（Roche Diagnostics公司，印第安纳波利斯，IN）。膜的完整性同时被碘化丙啶评估（PI）排除在膜联蛋白V染色的细胞。为了测量变化线粒体膜电位（MMP），细胞加载CMXRos（300 nm）的和MITOTRACKER绿色（100M）（均自Molecular Probes，俄勒冈州尤金）1小时，在37C。基质金属蛋白酶的亏损然后通过评估同时测量CMXRos保留（红色荧光）调整线粒体质量（绿色荧光）。细胞周期分布固定细胞，用70冰冷的乙醇和用PI染色溶液（25微克/毫升的PI ， 180 U / ml的RNA酶， 0.1 的Triton X -100，和30毫克/毫升西格玛化学），在4 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 7.8聚乙二醇。该DNA含量，使用FACScan流式细胞仪（Becton确定迪金森，圣何塞，加利福尼亚州） 。使用细胞周期分布进行分析MODFIT LT软件（ Verity的软件大厦，托普瑟姆， ME） 。Western blot分析Western印迹分析，以确定各种蛋白质的水平做如前面所述。24简言之，将经处理的细胞用PBS洗涤并裂解在蛋白质裂解缓冲液（0.25M Tris-盐酸， 2SDS， 4 -巯基乙醇，10甘油和0.02 溴酚蓝） 。细胞的等量溶胞产物上样到12 SDS-PAGE凝胶仪（Bio Rad ，赫拉克勒斯，CA）。至测量从线粒体释放到胞质溶胶中的细胞色素C，细胞用冰冷的裂解缓冲液（25mM Tris-HCl和5mM的氯化镁 pH值7.4 ） 。收集上清液，通过离心，通过分析Western blot检测，并探讨与抗细胞色素C（ PharMingen公司，圣迭戈，加利福尼亚州）的抗体。与第二抗体温育后，将膜反应与ECL溶液（ Pharmacia公司，白金汉郡，英国） 。由一个被检测到的信号磷屏（风暴860 4.0版，分子动力学，桑尼维尔，CA）。 ？ -肌动蛋白被列为负荷控制。荧光定量逆转录 - 聚合酶链反应（ RT-PCR）RNA从雷公藤治疗OCI- AML3细胞的Trizol分离解决方案（生命科技，大岛， NY ） 。 RNA的reversetranscribed禽流成髓细胞瘤病毒（ AMV ）逆转录酶（ Roche Diagnostics公司），在42下进行1小时。 PCR扩增反应混合物（ 25 L ）中含有的cDNA ， XIAP蛋白的正向引物（ 5- CCCAAATTGCAGATTTATCAACG - 3）， XIAP的反向引物（ 5- TGCATGTGTCTCAGATGGCC - 3）， XIAP的探针（ 5- ATCTGGGAAGCAGAGATCATTTTGCCTTAGAC - 3），和TaqMan通用PCR扩增预混试剂（ PE应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚州） 。 2-微球蛋白（2 -m）的共扩增与XIAP被列入作为变量的标准化的内部控制cDNA的每一个样品中含量（正向引物，5 - AGCTGTGCTCGCGCTACTCT -3; ？反向引物，5 - TTGACTTTCCATTCTCTGCTGG -3; ？和探针，5 - TCTTTCTGGCCTGGAGGGCATCC -3 ？ ） 。热循环条件包括保持反应在50进行2分钟并在95 下进行10分钟，并循环为在95 下进行40个循环为15秒和60 1分钟。结果被收集，并用分析ABI PRISM 7700序列检测系统（PE Applied Biosystems）进行如如下：生成第1荧光信号的PCR循环数高于阈值（阈值循环，CT，上面的10个标准偏差意味着在基准周期产生的荧光）确定，和一个比较CT法，然后用于测量相对基因表达。下面的公式用于计算相对量的处理的样品（倍）权益的成绩单和控制样本（Y），这两个归一化的内源参照（2 - 米）： 2- 用CT，其中CTIS的兴趣和？ 2米的基因CTbetween的差异，和CTfor样本XCT （x ） ？ CT （ Y） 。25集落形成实验的集落形成测定如先前所述进行。26简言之，将1105从AML患者的骨髓单核细胞镀在Iscoves 0.8 甲基纤维素改性Dulbecco培养基补充有10FCS和15 ng / mL的重组人粒细胞集落刺激因子（抗hGM -CSF） 。雷公藤内酯醇加入在培养物在10 100nM的浓度开始。反洗钱爆炸文化在重复7天，在显微镜下菌落评价菜肴。从正常骨髓细胞接种在Iscoves 0.8 甲基纤维素改性Dulbecco培养基， 1个单位/ mL人促红细胞生成素（安进公司，千橡，加利福尼亚州）和50 ng / mL的重组HGM- CSF 。雷公藤混合物在10 100nM的浓度添加。所有的文化都14天后，以确定菌落形成单位数分析：集落形成单位粒细胞 - 巨噬细胞（ CFU-GM ）和菌落爆裂形成单位 - 红细胞（ BFU-E ）集落统计 所有的实验都进行3次以上，结果是表示为平均值加上或减去标准误差（SE），除非另有说明。雷公藤甲素诱导膜联蛋白V阳性的浓度细胞的50，使用Calcusyn软件（BIOSOFT，弗