溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜IκBα、IKKβ蛋白表.doc

溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜IkBa、IKK蛋白表达的作用作者简介：唐立海（1983），男，博士研究生。通讯作者：杜群，研究员，研究方向：中西医结合中药药理，Email: 。*基金项目：国家自然科学基金资助项目（编号：30873421）唐立海，纪艳艳，杜 群，李燕舞，巫燕莉，柴玉娜，陈 昫，王汝俊（广州中医药大学脾胃研究所，广州 510405）摘要：目的 观察溃结灵对溃疡性结肠炎（UC）大鼠模型结肠黏膜核因子B抑制蛋白-a（IkBa）及IkB激酶（IKK）的蛋白表达作用，对其抗UC作用机制进行探讨。方法 采用三硝基苯磺酸（TNBS）法复制UC大鼠模型并进行不同剂量药物干预。采用Western blot方法检测结肠黏膜IkBa、 IKK蛋白相对表达量。结果 模型组IkBa蛋白相对表达量明显低于正常组（P0.05）,溃结灵高剂量组IkBa蛋白相对表达量显著高于模型组（P0.01）,中剂量组IkBa蛋白相对表达量明显高于模型组（P0.05）；模型组IKK蛋白相对表达量显著高于正常组（P0.01），溃结灵高、中剂量组IKK蛋白相对表达量均明显低于模型组（P0.05）。 结论 溃结灵对TNBS法UC大鼠模型结肠黏膜IkBa蛋白表达的上调作用及对IKK蛋白表达的抑制作用，可能是其抑制NF-B的活化，减轻炎症反应的作用机制之一。关键词 溃结灵 溃疡性结肠炎 大鼠模型 IkBa IKKThe effect of Kuijieling decoction on the protein expression of IkBa and IKK in Colonic Mucosa of UlcerativeColitis Model RatsTANG Lihai，JI Yanyan，DU Qun， LI Yanwu，WU Yanli，Chai Yuna，Chen Xu， WANG Rujun，（Pi-Wei Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）Abstract：Objective To observe the effect of Kuijieling Decoction （KD）on protein expression of IkBa and IKKin colonic mucosa of rats with ulcerative colitis （UC）and to explore its possible mechanism. Methods Trinitro-benzene-sulfonic acid（TNBS）method was used for the establishment of UC rat model. After treatment with different dosages of KD, Western blot technique were used to detect protein expression of IkBa and IKKin Colonic Mucosa. Results The relative expression of IkBa protein in model group was obviously lower than that in normal group（P0.05）, the relative expression of IkBa protein in high dosage group of KD was significantly higher than that in model group（P0.01）, the relative expression of IkBa protein in middle dosage group of KD was obviously higher than that in model group（P0.01）;The relative expression of IKKprotein in model group was significantly higher than that in normal group（P0.01），the relative expression of IKKprotein in both high and middle dosage groups of KD were significantly lower than that in model group（P0.05）.Conclusion The relative expression of IkBa protein is enhanced and the relative expression of IKKprotein is Inhibited in colonic mucosa of UC model rats induced by TNBS after treatment with KD，Its possible mechanism may inhibit the activation of NF-B and reduce inflammatory reaction.Keywords： Kuijieling Decoction；Ulcerative colitis；Rat model；IkBa；IKK溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC)又称非特异性溃疡性结肠炎，可发生于任何年龄,与结肠癌的发病有关，其发病机制复杂，常反复发作，治愈难度大1。核转录因子B（nuclear factor-B，NF-kB）是与炎症反应、细胞增殖和凋亡等密切相关的转录因子，在细胞静息状态下与IB ( inhibitor of NF-B) 结合形成复合物，使NF-kB滞留在胞质中呈非活性状态。当受到特异性激活剂的刺激时，IKK(IB kinase)被激活，使IB蛋白降解，NF-kB从胞质转位至胞核从而调节多种基因的转录2,3。我们在多年临床实践的基础上，以清热健脾活血为治则，总结出溃结灵中药复方4，前期的研究表明溃结灵能明显抑制模型大鼠结肠组织NF-kB的活化5。NF-kB的激活涉及IB的降解，而后者有赖于IKK的调控，IKKIBNF-kB是一个有机联系的系统。因此本文采用Western blot法观察溃结灵对UC大鼠模型IkBa和IKK的蛋白表达的影响，探讨其抑制NF-kB活化的作用机制。1 材料与方法1.1动物 SD大鼠，SPF级，雄性，体重180-220g，广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)2008-0002。1.2药物 溃结灵药材（救必应，白术，白芍，水蛭等）购于采芝林连锁药店，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定，所购药材均符合中华人民共和国药典标准。按组方比例称取药材，常规方法制备水煎液。大鼠低、中、高剂量按成人用量的5，10，20倍计算，即含生药量4.6，9.2，18.3 g/kg，药物用蒸馏水配成460、920、1830 g生药/L。柳氮磺胺吡啶（SASP），批号：200906005，上海三维制药有限公司，用作阳性对照药物，大鼠取10倍成人用量即0.5 g/kg，药物用蒸馏水配成50 g/L。1.3试剂与仪器 三硝基苯磺酸（TNBS，美国Sigma, 批号：021M5009）；Biovision mammalian cell Extraction kit 试剂盒（美国Biovision，批号：50569）；凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（凯基生物公司，货号：KGPBCA）；Bio-RAD电泳仪（美国Bio-RAD公司，型号：164-5050）；Western Breeze（invitrogen公司，批号：815192）；-actin一抗（Santa Cruz公司，批号：H1709）；IkBa一抗（Cell Signaling公司，批号：4814S）；IKK一抗（Cell Signaling公司，批号：2370）；羊抗小鼠二抗（bioworld公司，批号：315466）；羊抗兔二抗（bioworld公司，批号：315398）；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒（TIANGEN公司，批号：J8303）；Bio-RAD扫描仪（美国Bio-RAD公司，型号：GS-800）。1.4 模型复制 采用TNBS灌肠法制作UC大鼠模型6。取3月龄SD大鼠，造模型前禁食24 h，除部分大鼠作为正常对照组外，其余大鼠乙醚麻醉，用大鼠灌胃针头轻轻从肛门插入，深度为8 cm，推入TNBS溶液（含25 g/L TNBS和体积分数50 %乙醇）4 mL/kg体重，捏紧肛门平放5 min即可，术后常规饲养。1.5给药方法与标本留取 造模后第3天，模型动物分为模型对照组，溃结灵低、中、高剂量组和阳性对照组，并按上述剂量给药，给药容积为10 mL/kg。正常对照组及模型对照组给等容积蒸馏水，每天1次，连续10 d。末次给药24 h后，脱颈椎法处死大鼠，取距肛门8 cm结肠，沿纵轴剪开，刮取肠黏膜组织，即置于液氮中速冻，转入-70 冰箱保存。1.6 IkBa和IKK蛋白表达 Biovision mammalian cell Extraction kit 试剂盒提取结肠黏膜全细胞蛋白，蛋白定量用BCA法蛋白定量测定方法检测。蛋白样本变性后经SDS-PAGE电泳（100g/泳道）、转膜及一抗4孵育过夜（-actin 1:500、IkBa 1:1000、IKK1:1000），二抗摇床孵育2h(HRP标记的羊抗小鼠二抗 1:2000，HRP标记的羊抗兔二抗1:2500)。DAB显色后用光密度扫描仪对蛋白含量进行密度分析，以目的蛋白与-actin的密度比值作为目的蛋白的相对含量，并进行组间比较。1.7 统计学处理 应用SPSS11.0软件进行统计学处理，各组间均数比较采用单因素方差分析，以P0.05为差异具有统计学意义。2 结果 2.1 溃结灵对UC模型大鼠肠黏膜IKK蛋白表达的影响 TNBS法UC模型大鼠肠黏膜IKK蛋白相对表达量显著高于正常组（P0.01），溃结灵高、中剂量组IKK蛋白相对表达量均明显低于模型组（P0.05），见表1，图1。表1 溃结灵对UC大鼠结肠组织IKK蛋白表达的影响(s)组别n剂量/gkg-1相对表达量正常组10-0.3450.091*模型组10-0.4990.123SASP组100.50.3340.142*溃结灵高剂量组1018.30.3210.154*溃结灵中剂量组109.20.3630.145*溃结灵低剂量组104.60.4400.198注：与模型组比较，* P0.05，* * P0.0187KD 43KD 正常 模型 阳性 高 中 低图1 IKK蛋白表达条带图2.2溃结灵对UC模型大鼠肠黏膜IkBa蛋白表达的影响 TNBS法UC模型大鼠肠黏膜IkBa蛋白相对表达量明显低于正常组（P0.05）,溃结灵高剂量组IkBa蛋白相对表达量显著高于模型组（P0.01）,中剂量组IkBa蛋白相对表达量明显高于模型组（P0.05），见表2，图2。表2 溃结灵对UC大鼠结肠组织IkBa蛋白表达的影响(s)组别n剂量/gkg-1相对表达量正常组10-0.5490.178*模型组10-0.3880.104SASP组100.50.5480.177*溃结灵高剂量组1018.30.5870.153*溃结灵中剂量组109.20.5500.149*溃结灵低剂量组104.60.4700.173注：与模型组比较，* P0.05，* * P0.0139KD 43KD 正常 模型 阳性 高 中 低图2 IkBa蛋白表达条带图3 讨论对UC起主要致病作用的细胞因子，如TNF-、IL-1、IL-6、IL-8等在基因转录阶段受NF-kB调控7。NF-kB对黏附因子、趋化因子、诱生型酶COX-2、iNOS等表达均有调控作用8。研究表明，UC患者的结肠粘膜组织核内NF-kB DNA结合活性明显升高9-10，绝大多数细胞因子基因启动子或增强子部位均有NF-kB结合位点，活化入核的NF-kB即可与之结合并促进这些细胞因子的转录11-12。因此，NF-kB在UC的病理生理过程中可能起到枢纽作用，是细胞因子转录及释放的前提和关键。我们前期的研究结果也表明，溃结灵对UC大鼠结肠黏膜NF-kB DNA结合活性有抑制作用5。在大多数细胞中，NF-kB二聚体与NF-kB抑制蛋白IkB结合形成三聚体，以无活性形式存在于细胞浆中。当受到某些刺激因素(如紫外线、脂多糖、病毒等)的作用，IkB (尤指IkBa)被IKK催化发生S32和S36位点的磷酸化，磷酸化的IkB可被SCF( Skpl/Cull/F-box protein)复合物所识别而泛素化，最终降解，NF-kB二聚体得以活化，从胞质转位至胞核从而调节多种基因的转录3。实验表明IkBa缺失的小鼠在出生后7-10天即死亡，出现的各种免疫病症与NF-kB被过量激活的表征一致13。所以，IkBa的降解以及低表达是NF-kB活化的关键步骤。IkBa降解的起始环节磷酸化是在活化的IKK复合体催作用下完成的，IKK复合体是NF-B信号通路的主要调节物，主要由3种亚基组成:催化亚基IKK/IKK1IKK/IKK2和调节亚基IKK /NEM O。IKK激活的是RelA /P50二聚体，它不仅可以使IB上的Ser32和Ser36发生磷酸化，还能使IB上的Ser19和Ser23发生磷酸化，所以IKK /NF-kB途径被称为经典途径。IKK /NF-kB信号途径是炎症反应的关键信号通路，IKK对IkBa的磷酸化是NF-KB激活的一个关键步骤，基因靶向实验已证实IKK是促炎因子激活NF-kB所必需的IKK亚基14。实验表明IKK+/细胞与正常细胞相比，IKK活性降低了两倍，而NF-B的活化程度下降了7080；小量IKK的激活就能引起大量IkBa的降解和NF-B的激活，说明只要IKK的激酶活性受到稍许减弱就会显著抑制IkBa的降解和NF-B的激活15。因此，观察药物对IkBa和IKK蛋白表达的影响，可以揭示药物深层次的作用机理。本实验结果显示，TNBS法UC大鼠的IKK蛋白表达显著高于正常对照组，而IkBa蛋白表达却明显低于正常对照组，两者呈负相关。表明UC大鼠IKK的活性升高，通过催化IkBa磷酸化，使其分子构象发生变化并降解，随着IkBa的减少，从而暴露NF-kB的核定位信号，使NF-kB由胞浆入核并与特定基因的kB部位结合，激活靶基因转录从而参与细胞分化、发育、凋亡、黏附及炎症反应，提示IkBa的低表达和IKK的高表达与UC的发病有关。IKK的活性升高，导致IkBa发生降解，从而使NF-B从多聚体中释放出来是可能是UC的发病的一个关键性因素。溃结灵高、中剂量组IkBa蛋白相对表达量明显高于模型组,而溃结灵高、中剂量组IKK蛋白相对表达量均明显低于模型组。表明溃结灵可能通过抑制IKK的活性来阻止IkBa磷酸化从而间接抑制NF-kB信号通路激活，减轻炎症反应。对IKK/IkBa/NF-B通路的干预作用可能是溃结灵治疗UC的作用机理之一。参考文献:1赵曼，高峰. 溃疡性结肠炎发病机制研究进展J. 现代生物医学进展，2010，10（16）：3160-3165.2 Harvey K A，Walker C L,et al Oleic acid inhibits stearic acid-induced inhibition of cell growth and pro-inflammatory responses in human aortic endothelial cellsJ J Lipid Res，2010，51( 12) : 3470-34803 Liu X，Sun J Endothelial cells dysfunction induced by silica nanoparticles through oxidative stress via JNK/p53 and NF-kappaB pathwaysJ Biomaterials，2010，31( 32) : 819882094黄志新，劳绍贤，崔琦珍，等. 溃结灵颗粒治疗活动性溃疡性结肠炎的临床和实验研究J. 中西医结合消化杂志，2003，11（3）：141-143.5杜群，李红，王建华，等溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜NF-B P65蛋白表达及血清TNF-含量的影响J. 广州中医药大学学报，2007, 24（5）：396-399.6张涛，谢建群大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究J. 中国中西医结合消化杂志，2006, 14（4）：240-242.7 Vallabhapurapu S, Karin M. Regulation and function of NF-kappa B transcription factors in the immune systemJ. Annu Rev Immunol, 2009, 27( 5) : 693-733.8Benitah SA, Valeron PF, Lacal JC. Rock and nuclear factor kappaB- dependent activation of cyclooxygenase-2 by Rho GTPases: effects on tumor growth and therapeutic consequencesJ. Mol Biol Cell 2003,14(7): 3041-3054.9Li Z, Zhang DK, Yi WQ, et al. NF-kappaB p65 antisense oligonucleotides may serve as a nove