PCR_RFLP.doc

【实验目的】1熟悉PCRRFLP分析技术原理及实验步骤。2掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。3了解PCRRFLP在遗传病基因诊断中的作用。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93-95)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50-70)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70-75）下沿模板按53方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。聚合酶链式反应限制性片段长度多态（PCRRFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCRRFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。本实验以家族性甲型血友病患者及其相关成员外周血DNA为模板，PCR扩增凝血因子F基因的583bp特异片段产物，其中包含MspRFLP多态位点，经Msp酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（583bp或360bp+223bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断胎儿是否得到了带有缺陷F基因的染色体，从而做出间接基因诊断。【实验用品】1DNA（50ng/l）、引物和（20）、TaqDNA聚合酶（5U/l）10PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶Msp（20U/l）、10酶切缓冲液。22%的琼脂糖凝胶、5TAE、6上样缓冲液、DNA Marker、溴化乙啶贮存液（10mg/ml）（EB）。3PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器（20l、200l）、枪头（20l、200l）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、浮漂、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。【实验步骤】一PCR反应PCR反应体系20l，其成分如下：按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.5ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。PCR 反应循环温度：94预变性3分钟，然后进行以下循环30次最后经72再充分延伸7分钟。反应结束后置4冰箱保存。二PCR产物的Msp酶切反应体系20l其成分如下：置37水浴消化1小时，4保存。三琼脂糖凝胶电泳检测1胶板的准备取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.51.0ml的位置放入梳子。22%的琼脂糖凝胶的制备称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65左右，加入2.5l溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5g/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。3将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓冲液，预电泳10min。4每份限制酶切产物取10l，加2l 6上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100V 电泳50分钟。5断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCRRFLP结果。【实验结果与分析】根据甲型血友病患者及其相关成员的