温度或PH值都会对蛋白质的折叠情况造成影响.doc

摘要 溫度或pH值都會對蛋白質的折疊情況造成影響，其影響因蛋白質而異。Snase在pH值=7時，會折疊成正常狀態（完全折疊），在值時已幾乎完成折疊，在pH值=時只有部分折疊，值時為一任意捲曲形狀(random coil)。所以本次實驗中我們以觀測跳到時蛋白質的折疊變化，並與理論結果作一比較。我們將以Photo acoustic calorimetry (PAC)及 photo-thermal beam diffraction (PBD)兩種實驗方法來研究蛋白質在反折疊過程中的熱與體積變化。PAC測量時間尺度介於10ns2us之間，而PBD測量時間尺度為10usms之間。一、研究動機當蛋白質沒有正確的折疊（誤折）時，可能會產生嚴重的後果，如許多知名的疾病:阿茲海默症(Alzheimers)及帕金森氏症(Parkinsons)等，都因為蛋白質折疊錯誤而無法正常工作，然而蛋白質折疊是個複雜的問題，所以我們所選擇的蛋白質是一個小的蛋白質，在文獻上整個折疊的過程較簡單，折疊完畢後是一個球型。藉由量測蛋白質折疊的訊號，與理論值做一比對，了解蛋白質詳細的折疊過程，甚至能進一步控制它的折疊反應時 ，就能有效控制及治療疾病，造福人群。二、研究目的了解Snase在改變pH值的條件下，反折疊發生在何種時間尺度，及量測在反折疊過程中的內能與熵的變化並與現在的熱力學模型做一比較。三、實驗器材實驗器材配置簡圖前置放大器為PBD(photo-thermal beam diffraction)的實驗器材，其功能為收光並把其轉換為電壓訊號。因為其收光處為一AB端子(如圖)當光打至正中央時AB兩端子所收到的光是一樣多的，不會產生電位差。一旦光出現偏折，產生電位差，其電壓訊號就會顯示於示波器上。吸收光譜儀 用以了解樣品對不同波長的吸收程度螢光光譜儀 用來測量螢光劑在不同溶液中的放光情形四、研究過程在做實驗之前，我們首先利用鏡子的反射讓整系統內的Probe laser經過同一平面(以二維座標為基礎)，因為這樣可簡化光路的複雜性。通常是利用兩面鏡子較好調控光路的上下及左右，這是實驗前的前置作業。 將Probe laser導至前置放大器的AB端子，並使之歸零。接著打開脈衝雷射將其光路導至ref中與Probe laser交於一點。脈衝雷射會激發ref使之放熱，週遭溶劑因熱膨脹而折射率改變後使Probe laser產生偏折。此實驗目的在使脈衝雷射及Probe laser準確交於一點，並試著從示波器上讀到訊號。接著我們用吸收光譜儀去掃D-7176的吸收光譜(A圖)，接著在不同的pH值中加入等量的D-7176,以D-7176吸收最多的波長去打各pH值溶液，看其所發出的螢光光譜(B圖)而得到類似下圖的結果。然後再以pH=4.5的溶液為基準液，依次加入0.5cc的o-NBA，利用D-7176在不同pH值中放出螢光強度不同(pH值越高，放光的強度越大)來觀察樣品的pH值變化。加到2cc時原溶液的pH值已從4.5因o-NBA被激發後降至2.88(符合Snase從摺疊至反摺疊的需要)，實驗結果如下圖，此溶液將為接下來Snase的溶劑。接著我們再剛剛調配好的溶液中加入20uL、4mM的Snase，以Probe laser通過樣品，再經放大器接收顯示在示波器上，校正後再用波長355的脈衝雷射激發o-NBA，使其放出氫離子降低樣品的pH值。則樣品的折射率可能因蛋白質的展開而改變，使原本穿過樣品的雷射光產生偏折，則放大器所收到的光會因偏折而使AB端子接收到不一樣多的光，產生電位差，接著以下是我們初步的研究結果與討論。五、實驗結果PAC（Photo acoustic calorimetry）的原理如下： 以下是以我們的實驗數據用電腦轉換成的簡圖圖一(PAC的結果)圖二(PBD的實驗結果)六、討論當樣品吸收光子後，會依循兩種路徑，一是放熱後導致樣品周遭溶劑體積發生變化，另一是樣品本身產生結構變化，而ref 是在此實驗的一種標準樣品，當ref吸收355nm的光後會100完全放熱而使周遭溶劑體積膨脹，故將其訊號歸一化後，可拿來做一對比，又因其放熱速率極快，故可量測時間尺度介於ns2us左右的事件，但若有比其反應更快的事情發生時，將無法解析。圖一黑線就是ref放熱後麥克風（壓電晶體）偵測到的訊號，顯示在示波器上的結果，而紅線部分則是Snase的結果。由圖中我們可以發現，在橫軸時間尺度上，兩者的行為幾乎是一樣的，這告訴了我們Snase因pH 改變所導致的反折疊過程是快或慢於儀器解析的（快於10ns，慢於2us）。在縱軸振幅上，Snase的訊號比ref小，表示Snace有放熱與結構變化存在。為了量測較長時間的結果（3usms），我們做了PBD （Photo thermal beam diffraction）實驗。PBD的實驗原理與PAC相似，但不同的是，PBD並不是用麥克風來偵測訊號，所使用的是一道Probe laser，所量測到的是折射率的變化，與PAC相似的是當樣品吸收光子後，也會依循兩種路徑，放熱或結構改變，受限於放大器反應的關係，一般而言此方法所能量測的時間尺度在usms之間。圖二是PBD所量測到的初步結果，我們發現在PBD的訊號在振幅上與ref相同，這在PAC上並沒有這樣的結果(振幅上略小於ref)，這告訴了我們也許Snase在這樣的時間尺度下可能有不同於PAC之結果，也許多了放熱或結構改變，這需要做不同溫度的實驗才能把這兩個因子分開，這也是我們下一個目標之一。七、結論因為Snase為149個氨基酸，屬於短鏈的高分子，所以其摺疊或反摺疊所需的時間預估極短。由上述實驗我們得知，時間尺度介於ns2us左右所量得Snase的訊號，與時間尺度在usms之間所量測Snase的訊號並不相同，這反應了在usms的時間尺度內多了放熱或結構改變，我們還需要做不同溫度的實驗才能把這兩個因子分開。此外我們還要對Snase做x光的小角度散射實驗已了解其反結構變化的狀況，與我們用PAC與PBD 的方法作一比較。八、參考資料及其他1. Photothermal Studies of pH Unfolding of Apomyoglobin (Journal of Protein Chemistry, Vol. 22, No.4, May 2003) J. Mol. Biol. (2003) 332, 114311532. Kinetics of proton transfer in a green fluorescent protein: A laser-induced pH jump study, Roop Mallik, Jayant B Udgaonkar and G Krishnamoorthy Proc. Indianl. Acad. Sci. (Chem. Sci.), Vol. 115, No. 4, August 2003, pp 3073173. Early Events During Folding of Wild-type Staphylococcal Nuclease and a Single-tryptophan Variant Studied by Ultrarapid Mixing, Kosuke Maki1, Hong Cheng, Dimitry A. Dolgikh M.C. Ramachandra Shastry and Heinrich Roder J. Mol. Biol. (2004) 338, 3834004. pH-Induced Folding/Unfolding of Staphylococcal Nuclease: Determination of Kinetic Parameters by the Sequential-Jump Method? Hueih M. Chen, Vladislav S. Markin, and Tian Yow Tsong, Biochemistry, Vol. 31, No. 5, 19925. Least activation path for protein folding: Investiga