酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定.doc

1材料与方法11材料111茵样菌样采自湖南、广东、广西和云南等四省(区)的12县(市)，包括原始森林中的腐烂树叶、剑麻土、甘蔗渣、酒醪、塘泥、污水、稍微腐烂的水果和蔬菜等；对照菌株(CK)为市售的丹宝利高温活性干酵母。112试剂和工艺辅料主要化学试剂有：无水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、11(三苯基四氮唑盐酸盐)、氢氧化钠溶液、盐酸和硫酸等，这些物质均为市售商品。113培养基富集培养基：YPD液体培养基(1酵母膏，2蛋白胨，2葡萄糖)，自然pH；种子培养液：YPD液体培养基；平板分离培养基：YPD琼脂、PDA；初筛培养基：TIC上层培养基，TTC 0059、葡萄糖059、琼脂059、加入100mL无菌水；Trc下层培养基，YPD琼脂；发酵培养基(YFM)：150r：L的葡萄糖，05酵母膏，pH值5o；斜面保藏培养基：YPD琼脂。12方法121样品处理称取固体菌样309左右，加入300mL无菌水中，120rmin摇10rain，两层纱布过滤，收集滤液备用；液体菌样不处理，直接用于富集培养。122富集培养取菌液10ml加入盛有富集培养基的锥形三角瓶中，添加适量的青霉素01俨05棚1制细菌的生长，于30。C恒温培养箱中培养2d，再取lml进行同条件传代培养，每2d接种继代1次，3次继代后进行分离纯化。123分离纯化将稀释的富集培养液，涂布于分离培养基平板上，置于30。C恒温培养箱中培养2d，挑取典型酵母菌落至YPD琼脂斜面，编号、培养，性能鉴定后将酵母菌划线分纯、保藏。124酵母茵的初筛利用产酒精能力强的酵母菌能还原三苯基四氮唑盐酸盐(TTC)变为深红色这一特性，筛选深红色菌落。将分离得到的各菌株依次接入Trc下层培养基的平皿中，培养24h，长出菌落后倒入TIC上层培养基，30。C下保温(阴暗处)23 h。比较各菌株之间的产酒精能力，初筛出产酒精能力强的酵母菌株，将酵母菌接种于YPD琼脂斜面培养基中，低温保藏。125酵母茵的复筛将斜面菌种接一环于新鲜的种子培养液中，于30。C，170rrain摇床培养24h。按10接种量将菌种接入装有100ml发酵培养基(YFM)的三角瓶中，于35。C培养箱，静置发酵72h后测产气情况万方数据第3期彭源德等：耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定137和酒精含量。126诱变育种以复筛后的酵母菌为始发菌，接种于种子培养液培养12h后，通过高温(45)处理20min、调整菌悬液浓度为106个ml，取5ml于无菌平皿中，进行紫外线处理(照射功率15w、照射距离20em、照射时间10min、杀伤率在9999以上)，然后对菌液进行分离、富培、纯化和菌株表型特征观察，菌体进行镜检。同时，对始发菌和诱变菌株进行乙醇发酵试验，发酵液起始葡萄糖浓度2009iL。127耐受性试验一般采用500ml锥形瓶盛培养液200ml，起始糖度为1509l，接种量5，自然pH，置35。C恒温静止培养72h，以丹宝利耐高温活性干酵母作对照，3次重复。根据研究目的设置的特定条件有：耐热性：分别在30、35、40和45条件下发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。耐乙醇能力：分别设置种子液的乙醇起始浓度为o、4、8、12、16和20，于35恒温培养24h，观察菌种生长，在660hm下测定培养液消光值(OD)。耐糖能力：分别设置发酵液糖的起始浓度为15091、2009l、25091和3009l，发酵72h，测定发酵液的酒精浓度。128测定方法酒精浓度采用酒精比重计法测定1121。2结果与讨论21酒精酵母菌的筛选酒精酵母菌的分离与筛选结果列于表1，从表中看出，采集的22个菌样中共分离出98个菌株，经初筛，获得12株酵母菌，占分离菌株的153；酵母茵广泛分布于4省(市)12个县(市)的8类菌样中；经复筛，获得4株(编号分别为：Sll、S12、S15、S17)耐高温的酒精酵母菌株，它们分别来自腐烂树叶、甘蔗渣、剑麻土和酒醪等菌样。从不同温度下酵母菌的生长情况表2和表3可以看出，复筛出的4株酵母菌株均能在40下较好的生长，耐热性能与对照菌株丹宝利耐高温活性干酵母相当。表l酵母菌的分离与筛选结果抖：生长良好。+：生长较好，4-：弱的生长，一：不生长万方数据138 中国麻业科学第32卷+：生长良好，+：生长较好。：弱的生长。一：不生长22耐受性酵母茵的诱变育种为了进一步提高优良菌株S15和S17发酵能力，对它们分别进行了高温处理和紫外线诱变育种试验，酵母菌诱变育种结果表4表明，高温和紫外线处理对该2株菌的产酒精能力均有不同程度的提高；并获得了1株产酒精能力比CK高126的酵母菌株，编号为S132。表4耐受性酵母菌诱变育种结果Tab4 Ethanol tolerance comparison before and after mutant treatment23茵落和菌体特征酵母菌在YPD琼脂平板及种子培养液中生长特征如表5。表中结果显示，酵母菌的菌落较湿润，表面光滑，容易挑取，菌落质地均匀，中间凸起，正反面以及边缘与中问的颜色较一致，菌落颜色比较单调，乳白色；液体培养基中均表现为底部生长，不形成膜或环；诱变处理获得的菌株S132的菌落形态和菌体特征见图l和图2，具酵母菌的典型特征，其属和种名有待于进一步鉴定。表5酵母菌的菌落形态特征Tab5 Colony characteristics of thermotolemnt yeasts图1 S132的菌落形态FigI Cobny characteristic ofye&st S1 3224耐受性初步鉴定241耐高温试验图2 S132的菌体特征Fig2 Cytomorphological characteristic ofyeast S132表6列出了不同发酵温度对酵母菌发酵性能的影响结果，由表6看出，3株菌株在30和36万方数据第3期彭源德等：耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定139均具有良好的发酵性能；S132和S15在40仍具有一定的发酵活性，与CK相比，发酵液乙醇浓度分别提高209和14，说明是很有潜力的耐高温酵母菌株。表6发酵温度对酵母菌发酵性能的影响玑出6 Influence of temperature oll fermentation ability of yeasts242耐乙醇试验酵母菌在乙醇含量0-20的YPD培养基中的生长情况见表7，从表中看出，四株酵母菌随着培养基乙醇浓度的增加，菌数不断减少，表明高浓度的乙醇含量会抑制酵母的生长繁殖。但S132对乙醇的耐受性大于对照，当培养基中乙醇含量为16时，耐乙醇能力比对照高15。表7不同乙醇浓度培养的酵母菌液消光值Tab7 OD values of yeasts fermented under different ethanol concentrations243耐糖性试验酵母菌耐糖性试验结果如表8。由表8看出，S132和S15的耐糖性能与对照相当，发酵液糖浓度由1509L提高到2009L时，乙醇浓度大幅度增加；糖浓度在2009m至3009m时，乙醇浓度变化不大。表8发酵液起始糖浓度对酵母菌发酵性能的影响Tab8 ne effect of starting concentration of gluco鸵：oil fermentation ability of yeasts3结论采取自然分离筛选与诱变育种相结合的方法，是选育高耐受性酒精酵母经济适用的方法之一。通过本研究可以得出以下结论：经富集培养，初筛、复筛，从22个菌样中共分离获得4株(编号分别为：S1l、$12、S15、S17)耐高温的酒精酵母菌株，它们分别来自腐烂树叶、甘蔗渣、剑麻土和酒醪等菌样；对S15、S17进行诱变育种，获得l株编号为S132的耐受性优良酒精酵母；选育获得酵母菌的菌落较湿润，表面光滑，容易挑取，菌落质地均匀，中间凸起，正反面以及边缘与中间的颜色较一致，菌落颜色比较单调，乳白色；液体培养基中均表现为底部生长，不形成膜或环，具酵母菌的典型特征；与对照丹宝利耐高温酵母相比，S132耐受40。C高温和乙醇的能力分别高出209和15，是一株良好的高耐受性酒精酵母。参考文献：【l】刘海臣，冉淦侨，张兴。等酒糟中超高温耐高酒精度酵母菌株的选育【J】酿酒科技，2007(5)：2831【2】刘畅，王涛，石翠芳耐高温酵母菌的筛选及特性研究忉酿酒，2007，34(2)：524【3】Cm R，Dhamija S，C,era T，et a1In-erie ethanol producing hybrids 0f thermotolerant Khyvefomycesnoil thermotolerant saham哪唧is唧】Bioteehnology Letters。1997，19：189-193 I下转第142页)万方数据142 中国麻业科学第32卷两因素的三个水平差异均不显著。4结论41确定因素的主次顺序通过以上方差分析，对亚麻原茎产量影响大小的因素排列顺序应为：播种期C品种A收获期D肥料B。42选出最优处理组合通过邓肯多重比较分析可以看出，对原茎产量因素而言，播种期的最优水平应该为C1，品种的最优水平为A1，而肥料和收获期的影响差异不显著，所以最优处理组合应为：ClAlDOBO(D0、BO各代表两因素的三个随意水平)。说明在云南宾川及类似的生态条件下，10月20日播种、应用Y5F070品种、施用525 kghm2复合肥(N：P：K=15：15：15)做基肥、施用525 kghm2复合肥(N：P：K=15：15：15)做追肥、在亚麻工艺成熟期适时收获可获得最高亚麻原茎产量。参考文献：【1】王玉富国内外亚麻原料种植与加工现状、向题与对策叨冲国麻业科学，2007，29(增2)：399-403【2J盖钧镒试验统计方法【M】北京：中国农业出版社，1999I上接第139页l【41 Balakumar S。Arasaramam V，Bahsubremaniam ICIflolatiort and improvement of a thermotolorant Saecharomyees eerebisine出aill叨WorldjournalofmicrobiobgyBiotechnology，2001，17：739-746f5】Sridbar M，Kiran Sree N，Venkateswar Ran LEffect of UV radiati帆on thnnnotole雠，ethanol tolerance and osmotoleaance ofSeceharomycescerevislaeVSI andVS3 stunsJBioresoureeTechnology2002。83：199-20261 Hamada A，Onitsuka N，Nozaki N，el aL Isolation and 80蛳properties of shechu yeast from Hyuga-nada of the Miyazakl exist叮Journal oftheBrewingSoeieqdJapan，2005，100(1)：5渊【7】Kajiwara SImproved Ethanol Tolerance and Fermentation of Saecharomyces cerevisiae by Alteiafim ofFatty Acid Coutent inMembrane Lipids via Metabdie Engineering们FoodsFood Ingred J Jpn，2003，208(4)：276-282【8J徐日益，梁磊，潘琢，等耐酒精酵母菌株的选育及其交叉耐受性的研究m酿酒科技，2007，10(10)：3436【9】Kiran Srce N，Sridhar M，Suresh k，et aL Isolation of thennotolerant，osmotolorant，flocculating Saecharomyces cerevislae forethanol productionJBioresourceTechnology，2000，72：43|6【lo】陈叶福。王正祥，王晨霞，等耐高温酵母菌株的分离、鉴定及其酒精发酵初步研究田微生物学通报。2003，30(5)：2427【11J Limtong S，Sringiew C，Yongma w。Productlon of fud ethanol at high temperature from sugar咖e julce by a newly isol,aedKuyveromyces峨iallus叨BioresourceTechnology，2007，98：3367-3374【12】胡嗣明，张天杭酒精生产分析检验聊】北京：轻工业出版社，1983万方数据耐高温、高浓度酒精酵母的选育与耐受性能初步鉴定作者： 彭源德， 朱作华， 唐守伟， 严理， 温岚， 汤清明， 熊和平， PENG Yuan-de， ZHUZuo-hua， TANG Shou-wei， YAN Li， WEN Lan， TANG Qing-ming， XIONG He-ping作者单位： 中国农业科学院麻类研究所,湖南,长沙,410205刊名：中国麻业科学英文刊名： PLANT FIBER SCIENCES IN CHINA年，卷(期)： 2010，32(3)被引用次数： 0次参考文献(12条)1.Kajiwara S Improved Ethanol Tolerance and Fermentation of Saccharomyces cerevisiae by Alterationof Fatty Acid Content in Membrane Lipids via Metabolic Engineering 2003(04)2.Kiran Sree N;Sridhar M;Suresh K Isolation of thermotolerant,osmotolerant,flocculatingSaccharomyces cerevislae for ethanol production 20003.Hamada A;Onitsuka N;Nozaki N Isolation and some properties of shochu yeast from Hyuga-nada of theMiyazaki coast 2005(01)4.Sridhar M;Kiran Sree N;Venkateswar Rao L Effect of UV radiation on thermotolerance,ethanoltolerance and osmotolerance of Saccharomyces cerevisiae VS1 and VS3 strains 20025.Balakumar S;Arasaratnam V;Balasubramaniam K Isolation and improvement of a thermotolerantSaccharomyces cerebisiae strain 20016.Cera R;Dhamija S;Cera T Intergeneric ethanol producing hybrids of thermotolerant Kluyveromyces &non thermotolerant Saccharomyces 19977.刘畅;王涛;石翠芳耐高温酵母菌的筛选及特性研究期刊论文-酿酒 2007(02)8.刘海臣;冉淦侨;张兴酒糟中超高温耐高酒精度酵母菌株的选育期刊论文-酿酒科技 2007(05)9.胡嗣明;张天杭酒精生产分析检验 198310.Limtong S;Sringiew C;Yongma W Production of fuel ethanol at high temperature from sugar canejuice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus 2007(17)11.陈叶福;王正祥;王晨霞耐高温酵母菌株的分离、鉴定及其酒精发酵初步研究期刊论文-微生物学通报2003(05)12.徐日益;梁磊;潘琢耐酒精酵母菌株的选育及其交叉耐受性的研究期刊论文-酿酒科技 2007(10)相似文献(10条)1.学位论文牛春铃 酒精酵母菌的高密度培养及其发酵性能的研究 2008高密度发酵是近年来发酵工业的重要研究方向之一。通过选育优良菌种，研究酒精酵母的高密度培养和发酵技术，提高酵母的酒精耐受性，降低产物或高渗透压底物对酵母发酵的毒害和抑制作用，提高酒精生产效益，对加快燃料酒精的产业化进程，推进绿色能源替代和国家能源安全，减少环境污染具有重要意义。本文通过选择优良菌种，采用恒速和分批补料流加培养方式，优化工艺条件实现了发酵液中较高的细胞密度和单位体积酒精产量；同时对高密度酵母酒精耐受性能、发酵性能和循环使用性能进行实验研究。本论文的主要工作和研究成果如下：(1)对酿酒酵母菌Saccharomy cescerevisiae As2.458进行摇瓶分批培养，在最适生长条件(摇床转速150rpm，温度28，初始糖浓度40gL-1，甘氨酸浓度3gL-1)下，菌体密度达到9.01gL-1。发酵糖浓度为250gL-1的木薯糖化液，生产酒精浓度达到11.7，比普通酵母浓度发酵生产酒精浓度提高24.5。实验结果表明提高发酵液酵母浓度，可显著提高发酵酒精浓度和单位体积酒精产量。但酿酒酵母酒精耐受性以及酒精致死量偏低，在酒精浓度为10时不能正常生长和发酵代谢，菌株作为工业酒精发酵菌种需要进一步改良。(2)通过分批、分批补料流加和连续恒速流加培养策略培养絮凝酒精酵母菌Saccharomy cescerevisiae4-S。结果显示，分批补料流加或连续流加(流加速率0.133gL-1m-1)有利于酒精酵母菌S.cerevisia4-S的快速生长和得到较高的细胞浓度，分批补料流加或连续流加培养44h，发酵液中酒精酵母细胞浓度(DCW)分别达到71.82gL-1和82.01gL-1，比分批培养分别提高了155.68和191.95，获得了较高的酒精酵母细胞浓度。(3)对高密度酵母酒精耐受性能考察，结果显示高密度酵母可耐受12(v/v)胞外酒精；菌体于30，18(v/v)酒精冲击2h的细胞存活率为42。发酵培养基中添加3gL-1甘氨酸、0.5gL-1(NH4)2SO4和2.6gL-1KH2PO4能有效提高菌体的酒精耐受性能，18(V/V)酒精冲击2h的细胞存活率提高到57。(4)利用Plackett-Burman实验设计确定了影响高密度酵母发酵性能的关键因素分别为糖浓度和胞外酒精浓度，响应面分析法优化两影响因素得出极值点分别为350gL-1和11.6(v/v)，通过验证性实验证实了模型的有效性。对优化后高密度酵母发酵性能的研究，结果显示酵母发酵糖浓度为350gL-1发酵液生产酒精浓度达到16.23，发酵时间比普通酵母浓度批发酵时间缩短12h，酒精浓度提高24.4。(5)对高密度酒精酵母进行循环酒精发酵实验，结果显示，前四批次生产的酒精浓度保持在13以上，显示出良好的可重复循环发酵能力；第五批次后酵母重复利用发酵生产酒精的能力呈明显下降趋势。经过活化的酒精酵母进行循环酒精发酵，前七批次发酵液中酒精浓度保持在13以上，第八批次后生产酒精浓度明显下降，说明中间活化对酒精酵母的重复循环发酵能力具有增强作用，但这在一定程度上增加了酒精发酵的成本，选择酒精酵母直接循环利用四次更经济。2.期刊论文易弋.伍时华.YI Yi.WU Shi-hua 酒精耐受性酵母菌的筛选 -广西工学院学报2008,19(3)从酒精厂废液、糖厂废糖蜜、土壤及淤泥等七种不同样品中,经富集、分离、纯化,筛选得到两株酒精耐受性较好的酵母菌株TM8和TM23.实验结果表明,两株酵母菌在9%的酒精浓度下,仍然能够保持一定的生长趋势.TM8在渗透压和低酸的耐受性上都要优于TM23.在含150 g/L,的葡萄糖的发酵培养基中进行发酵,TM8和TM23所得的酒精终浓度分别为4.0%和3.5%(v/v).3.学位论文薛军侠 酿酒酵母的筛选鉴定及耐受性初步研究 2006酿酒酵母是葡萄酒工业发酵最主要的酵母菌。优质葡萄酒的生产迫切需要具有产区特征、能体现葡萄酒特色和风格的优良酵母菌种。对我国本土酵母菌资源的研究是酵母菌种选种、育种的基础。宁夏、甘肃葡萄产区是优质葡萄酒生产区。本研究从分离自宁夏、甘肃地区的葡萄酿酒相关酵母菌中进行酿酒酵母菌的筛选、鉴定，同时，进行了酿酒酵母的耐受性初步研究。1 酿酒酵母的筛选与鉴定对分离自葡萄果实表面、酒厂设备、葡萄园土壤、葡萄自然发酵醪的酵母菌种经过WL培养基、赖氨酸培养基、菌落的形态特征及生殖方式的检测，初步确定58株酿酒酵母。经过糖发酵、碳源同化、氮源同化试验，与菌种鉴定手册对照，确认筛选的菌株为酿酒酵母。挑选部分菌株进行26SrDNA基因序列测序分析，使用Blast在线软件进行相似性分析，测序结果查询GenBank数据库，得到结果证实筛选出的酵母是酿酒酵母。实验对WL培养基、赖氨酸培养基、无性繁殖方式筛选三种方法进行比较，结果显示：对酿酒酵母筛选准确度高、简单易行的方法是无性生殖方式与WL培养基结合使用，尤其对大量菌种的筛选，能够节约时间，减少工作量，提高效率。2 对供试进行耐受性分析供试酿酒酵母普遍能够耐受10(v/v)酒精，少数不能耐受12(v/v)酒精，耐受能力较强的最多能耐受14(v/v)酒精，高于此浓度菌株不能存活。供试野生酿酒酵母普遍能耐受1.8mol/L KCl浓度，有个别菌株能耐受2.2mol/L浓度，仅有C242能耐受2.4 mol/L浓度。供试野生酿酒酵母只有菌株N5254、C190在37不能够生长，其它都能耐受37；而只有C242、C720能够耐受42，其他菌株在42都不能生长。野生酿酒酵母饥饿耐受力测试结果表明，所有菌株均能够耐受10d饥饿后而生长良好。野生酿酒酵母菌能够耐受50以下的葡萄糖浓度，但是均不能耐受60葡萄糖浓度。野生酿酒酵母对pH的耐受范围相当广泛，在pH为1.5时不生长，在pH为2.0时，生成红褐色的沉淀。其他酸度均能够生长良好，尤其在pH为4时。4.期刊论文梁新乐 苯甲醛高耐受性酵母菌的选育 -生物学杂志2003,20(1)介绍一种经过长期诱导、驯化作用来选育耐性菌株的方法.通过固定化细胞的间歇补料培养方式和长期诱导、驯化后,筛选出8株具有较高苯甲醛耐受性的酿酒酵母菌株,其中菌株Sbht-35-23对苯甲醛的耐受性达到0.9%,并保持较高的稳定活性.采用这些具有较高耐性的酿酒酵母菌株生物合成L-苯基乙酰基甲醇(L-PAC),将有利于提高转化率.5.学位论文梁磊 基于基因组改组技术选育多重抗性酒精酵母及甘蔗燃料乙醇发酵工艺研究 2009随着人类对石油开采的不断持续，一次性石化能源终究要枯竭，寻找替代能源成为全球关注的焦点，以燃料乙醇为主的生物能源是替代能源的一个重点。本课题研究针对发展甘蔗燃料乙醇产业的关键问题，利用基因组改组技术选育具有多重抗性的酒精酵母，并研究与之相配套的发酵工艺，提高发酵效率，缩短生产周期，有利于降低生产成本，为甘蔗燃料乙醇的生产提供理论依据和实验数据。采用诱变、驯化和基因组改组技术（genome shuffling）相结合的方法，构建具有耐高温、耐高酒精、耐高渗透压、耐低pH等多重抗性的优良酵母菌株。从本实验室收集和保藏的60多株糖质原料发酵酒精酵母中，挑选24株较常用到的糖质原料发酵酒精酵母为出发菌，采用生长培养和蔗汁发酵试验分析的方法，筛选出蔗汁发酵综合发酵性状相对突出酵母菌6株，分别为：G2-24，G2-05，G2-17，G2-53，GZ-01和G2-58。通过在各种不同胁迫条件下的发酵实验，优选得到3株酵母菌：其中G2-24为耐高温酵母菌、具备较高的酒精发酵效率，G2-05为耐较高浓度酒精和渗透压，G2-58耐较低pH值。以G2-24为出发菌株，经过用紫外光诱变和温度渐进驯化相结合的方法进行定向高温驯化后。共得到7株耐42高温的酵母菌。其中在40条件下，G2-241较出发菌G2-24酒精产量提高了11。选择G2-241作为基因组改组的耐高温正突变株。以G2-05为出发菌，经过8轮酒精浓度梯度逐渐上升的酒精处理细胞群体在含18的酒精的培养液中培养48h存活率增加到了408。筛选得到的耐酒精群体称为G2-05E。再对经过酒精冲击驯化的耐酒精群体进行三个周期高渗透压驯化实验。筛选得到酵母菌G2-0533浓醪发酵时，产酒精度达152（v/v），较出发菌株G2-05的酒精产量相对提高了125。G2-0533耐酒精和耐渗透压得到明显提高，作为基因组改组的耐高酒、耐高渗透压正突变株。以G2-58作为出发菌，经过化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理，涂布于低pH筛选平板上，挑选突变子4株。经过比较4株突变株和出发菌的点滴平板生长情况，筛选出的G2-582菌株耐低pH性能较出发菌有较大的提高。通过优化原生质体的制备条件为溶壁酶浓度为2 mg/mL，酶解时间均为30 min。G2-241的原生质体经过65，35 min处理，灭活率达到100； G2-0533和G2-582的原生质体经过65，30min处理完全失去再生能力。G2-241和G2-0533的原生质体，经15W，30cm紫外线照射15min可以完全灭活原生质体。G2-582的原生质体，经15W，30 cm紫外线照射20 min可以达到完全灭活原生质体的效果。原生质体电穿孔融合的预排列交流电压为8V（场强400V/cm），脉冲电压200 V（场强10 kV/cm），脉冲时间数30 s，脉冲次数3次。通过Genome shuffling技术将酵母菌株的多重耐受性能集中于同一菌株，从而选育出多重抗性的酒精酵母。以分别经过热灭活和紫外灭活的酵母GZ-0533、GZ-241、GZ-582为亲本菌株，经过3轮基因组改组（genome shuffling）后，筛选得到的28株酵母菌。第二次shuffling得到的MSR14和第三次shuffling得到的MSR23对多重胁迫条件的耐受性提高最多，酒精产量分别达到858和886，较多重抗性最好的出发菌GZ-05相对提高了7和105。26SrDNA序列分析表明，MSR14和MSR23的26SrDNA序列与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性为100，均认定为酿酒酵母。点滴YPD平板培养观察，MSR14和MSR23细胞菌落形态不一致，与出发菌株相比，其对外界胁迫条件的耐受性也得到一定的提高。推测酵母细胞对外界胁迫条件耐受性的变化，可能是由保守区序列以外的其他基因发生改变引起。在多重抗性酵母选育的基础上，进行蔗汁酒精发酵工艺研究。研究了高酵母菌接种量的抑菌特性及对蔗汁酒精发酵过程的影响。混合杂菌与酵母以不同浓度配比接入蔗汁发酵培养基中进行发酵实验，结果表明，当增加酵母接种量达到5107个/mL时，醪液中乙醇浓度没有明显降低。利用鲜甘蔗汁直接发酵时，接种量为5107个/mL，乙醇产量达1054（v/v），与使用经高温灭菌的甘蔗汁作培养基，酵母接种量为2107个/mL时相当，但发酵速度明显快于后者。其发酵上清液中未检出抑菌成分，说明提高酵母的接种量可以有效抑菌的原因可能是酵母的生长处于竞争优势，抑制了杂菌的生长代谢。本研究结果为蔗汁发酵生产燃料乙醇降低染菌风险提供了参考。以甘蔗块为载体固定酵母细胞，通过优化载体大小和预处理方式，制备得到性能优良的固定化酵母，应用于蔗汁燃料乙醇的生产。研究结果表明，大量酵母细胞固定于甘蔗块内部空腔以及吸附于甘蔗块表面；较小的甘蔗茎块作为固定化载体，酒精产率增加10左右；冷冻储存的甘蔗块经过解冻、去木质素处理后固定酵母，以40的装填率发酵36h，乙醇浓度达9934g/L，糖利用率为9923，发酵效率为9309。对该固定化酵母进行了产乙醇条件优化。在以蔗汁为发酵原料的情况下，研究了温度、初始pH、氮源、无机盐等条件对固定化酵母生产乙醇过程中的二氧化碳生成速率、酒精度、发酵效率、糖的利用率的影响。总结出发酵条件为：30、pH38、15 g/L酵母抽提物、05g/L磷酸二氢钾，酒精度最高达到1259，发酵效率达到9456，糖的利用率均在99左右。6.期刊论文易弋.黎娅.容元平.李凯酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选 -安徽农业科学2009,37(34)目的筛选酒精耐受型酿酒酵母菌最佳菌株.方法利用紫外线对酿酒酵母JL2008 进行诱变处理,并结合氯化三苯四氮唑(TTC)进行筛选,对5株对酒精具有较强耐受性的突变株SC1SC5的酒精耐受性进行比较,选择出2株酒精耐受性较强的突变株(SC1和SC5)进行酒精发酵,测定其生长速率和发酵性能.结果2株菌的酒精耐受能力远远高于出发菌株,均能在酒精体积分数为9%的培养基上生长;在含糖15%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率与原始菌株大致相同;在含糖30%的培养基中,SC1的酒精发酵终浓度和发酵效率分别是16.54%和85.2%,均高于原始菌株.结论突变株SC1在含酒精培养基中的生长和在浓醪条件下的发酵效果优于JL2008,是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株.7.学位论文郜希璐 白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究 2009酵母是工业酒精发酵和酒类饮料发酵不可或缺的微生物，对发酵过程中乙醇的产量起着关键的作用。我国白酒酿造一般采用含有复杂微生物种类的酒曲进行，并在酒窖这种特殊的发酵环境中进行发酵，因此酒窖中的窖泥中有非常丰富的微生物群系，包括种类丰富的酵母。本试验的目的是从某白酒厂提供的窖泥中分离酵母菌，对其生理生化特性和发酵特性进行鉴定，以期获得可以工业应用的酵母菌种。本试验将窖泥接种至麦芽汁液体培养基进行增菌培养，然后将增菌培养液接种至含有氯霉素的YEPD琼脂培养基，培养后选取符合酵母菌落特征的菌株98株，用于之后的进一步筛选和鉴定。对这些菌株进行温度适应性试驻，将其接种至YEPD液体培养基，分别于32、36、40、44、48条件下培养，获得耐受44温度的菌株18株。将该18株菌接种至YEPD琼脂培养基，生长后加入TTC上层培养基，通过颜色的变化观察其呼吸强度，选取呼吸强度高的红色菌落进行菌株的乙醇耐受性试验。将这些菌株接种至含10乙醇和加有杜氏小管的YEPD液体培养基中进行培养，其中有10株菌生长良好，表现出对乙醇的耐受性。对上述10株菌进行形态学观察和生理生化鉴定，10株菌均为酵母菌，分别属于5个种，其中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)4株，异形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)2株，鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxil)2株，耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)1株，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)1株。从上述5个菌种中各选取1株菌进行生长和发酵特性研究，获得了各株菌的最适生长和最适发酵条件参数。其中酿酒酵母A1在最适培养条件下乙醇产量最高。以酿酒酵母A1作为出发菌，以玉米面为发酵原料，探索了温度、pH、接种量、摇床速度、氮源等因素对乙醇产生量的影响，获得的优化发酵条件的参数。本试验从白酒窖泥中分离出了5种共10株耐高温、呼吸强度高和耐乙醇的酵母菌种，对其生长和发酵特性进行了研究，并对1株菌进行了发酵条件的研究和优化。在阐明白酒酵母菌系的同时，所获得的酵母菌种有望用于工业化生产，具有良好的应用前景。8.学位论文唐炼 开菲尔中酵母的分离鉴定及其与乳酸菌共栖关系的研究 2009乳酸菌和酵母是开菲尔中的两大主要菌群，两者之间具有复杂的共生关系，研究发现开菲尔中部分酵母能够耐受低pH和高浓度胆盐。本文以此为出发点，研究开菲尔中发酵过程中的微生物变化趋势，从中筛选出益生特性良好的酵母并研究其与乳酸菌在共培养时的相互关系，最后对酵母菌与乳酸菌共栖机理进行研究与探讨，以期为多微生物混合发酵的应用提供良好理论依据。本文的主要研究结果如下：1.研究了开菲尔在不同发酵温度下的微生物菌相变化，发现30利于发酵初期乳酸菌、醋酸菌和好氧菌等数量的增加，但20发酵条件利于发酵后期乳酸菌、醋酸菌和明串珠菌等活菌的保持，并且发现在20发酵条件下更利于开菲尔中酵母菌活菌数的增加。2.从开菲尔中分离、筛选和鉴定，得到6株不同的酵母，分别为无名假丝酵母(Candidafamata)(K1)，浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)(Ks2)，乳酒假丝酵母(Candidaker)(K2和K4)，克鲁斯假丝酵母(Candidakursei)(DX)，圆球形假丝酵母(Candidasphaerica)(K3)和近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)(P3)，这些酵母菌株对盐酸(pH2.0)和猪胆盐(0.3)均具有良好的耐受性，说明这些酵母能通过动物胃部，并能在肠道中存活。3.将植物乳杆菌ATCC8014与酵母K2进行共培养，发现酵母K2促进植物乳杆菌ATCC8014的增殖，但酵母K2却明显受到ATCC8014菌株的抑制，说明两者的关系属于拮抗关系。共培养时K2可促进ATCC8014乳酸产量增加，其增量最高达35.4，并使ATCC8014对6mmol/LH2O2的耐受性增强411.07。但共培养时ATCC8014对猪胆盐和HCl的耐受性不受影响。4.在培养基中添加GSH不能增加ATCC8014对HCl和胆盐的耐受性，但能增加其对6mmol/LH2O2的耐受性。K2与ATCC8014共培养时，K2分泌到发酵液中的GSH达76.67mol/mL。研究表明，酵母具有明显的过氧化氢酶(CAT)活性，在共培养时能有效降解外源H2O2，K2和ATCC8014共培养时，ATCC8014对H2O2的耐受性增强。K2在与ATCC8014共培养时可产生乙醇的浓度为0.54，该浓度下可对ATCC8014的生长起到促进作用。9.学位论文王世梅 耐酸性酵母菌R30加速污泥生物沥浸进程机理研究 2007污泥是污水处理过程中产生的沉淀物,污泥中除含重金属外,还含有丰富的有机质,氮、磷等其他养分,不合理的处置方式,既污染环境,又浪费资源,污泥处理应遵循无害化、资源化的原则。本实验室利用从污泥中分离出的两株硫杆菌-嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus.ferrooxidans)LX5、嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)TS6,对污泥进行生物沥浸(Bioleaching)处理,研究内容集中在污泥生物沥浸条件优化方面,但沥浸周期较长,如实施工程化应用,成本较高。污泥生物沥浸周期长的主要原因是在沥浸中起主要作用的自养硫杆菌生长缓慢,尤其污泥中的溶解性有机物(dissolved organic matter,DOM)对硫杆菌有毒害作用。为了消除这一障碍因子,尝试从污泥中分离出以污泥DOM为碳源和能源的耐酸性异养菌,研究其与自养菌复合进行污泥生物沥浸,并对其加速污泥沥浸进程机理进行深入研究。论文主要结果如下：从制革污泥中分离出一株异养菌R30,经鉴定属于红酵母菌属(Rhodotorula sp.),酵母菌R30在污泥DOM中培养96 h,水溶性有机碳(DOC)从1485mg/L降至345mg/L,菌数达4.8107个/mL,结果表明酵母菌R30可消耗污泥中大部分的DOM,减弱DOM对硫杆菌的毒害作用。为验证酵母菌R30对制革污泥沥浸的促进作用,在沥浸的起始阶段添加一定量的酵母菌R30,结果表明添加酵母菌处理和对照相比,污泥沥浸时间减少了4d,沥浸周期显著缩短,在7d的沥浸时间内,重金属Cr的溶出率提高39。研究在沥浸中起主要作用的菌株A.ferrooxidans LX5、A.thiooxidans TS6和Rhodotorula sp.R30对重金属铬(Cr3+)的耐受性。结果表明700mg/L的Cr3+对A.fLX5、A.tTS6的生长和氧化活性影响不大,但Cr3+浓度大于500mg/L时明显抑制酵母菌R30的生长。研究纯种A.fLX5和A.tTS6与酵母菌R30复合能明显加速污泥沥浸的进程,最佳的复合比例为硫杆菌LX5和TS6接种量10,酵母菌R30接种量2.0。研究含酵母菌R30的酸化污泥作接种物的可行性,结果发现生物沥浸过程中pH值下降的速度与对照比没有明显差异,而在沥浸起始时添加2.0的酵母菌R30,则沥浸反应提前36 h结束。因此在其它条件相同的污泥沥浸中,污泥中所含耐酸性酵母菌的数量很重要,在沥浸起始时添加酵母菌R30,使污泥中酵母菌的数量达到106个/mL是加快沥浸速度的关键。A.f