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实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术【实验目的】掌握PCR反应的原理及操作技术。【实验原理】PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 67 个拷贝。【器材与试剂】1器材DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统2材料模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。3试剂(1) 10PCR 缓冲液(2) MgCl2 15mmol/L(3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L(4) Taq DNA 聚合酶：5U/l(5) 引物1和引物2：2 mol/L(6) 琼脂糖凝胶电泳试剂【操作步骤】1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20l 反应体系。ddH2O7.8 l10PCR 缓冲液2 lMgCl2（15mmol/L）2 ldNTP（2.5mmol/L）2 l引物1 (2mol/L)2 l引物2 (2mol/L)2 l模板DNA2 lTaq DNA 聚合酶（5U/L）0.2 l总体积20 l2按下述循环程序进行扩增程序阶段程序名称温度时间循环数1预变性943 min1变 性9430 sec30 2退 火5230 sec延 伸7230 sec3保 温413扩增结束后，取10l 扩增产物进行电泳检测。【要点提示】1在9095下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般9495下3060sec。时间过长使TaqDNA聚合酶失活。2退火温度一般在4555。退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。3延伸温度一般在7075。此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。4引物长度通常用20bp左右。 两个引物扩增的片段大小3
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