实验四大蒜细胞SOD的提取和分离.doc

实验四 大蒜细胞SOD的提取和分离实验目的通过大蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE 和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT 等活性氧清除剂的含量水平和O2.、H2O2、OH. 和O2 等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD 和Cu.ZnSOD，它们可催化下列反应：O2. O2. 2HSOD H2O2O2H2O2CAT H2O 1/2O2由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD 活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD 的活力。邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物，在420nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。 颜色深SOD逐渐增多颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。器材与试剂一、器材恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、玻璃研钵、玻棒、烧杯、量筒、精密pH试纸二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、A液：pH8.2,0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液(内含1mmol/EDTA-2Na)。称取1.2114gTri和37.2mgEDTA2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml.（缓冲液需调pH8.2）3、B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐溶液。称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容到100mL.4、10mmol/L盐酸溶液 （注：常用的浓盐酸是37%-38%，密度为1.19g/ml, 浓盐酸摩尔浓度约11.7）5、0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)（自查，先分别配置pH7.8Na2HPO4和NaH2PO4溶液，后以适当配比组成)6、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:57、丙酮：用前需预冷至4-10实验步骤1、组织细胞破碎：称取3g大蒜蒜瓣，置于预冷研钵中，加入少量的石英砂及5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，冰浴上研磨成匀浆，移入15mL离心管。用5mL磷酸缓冲液冲洗研钵，洗涤并入离心管中，磷酸缓冲液的最终体积为10mL，全部转入离心管中，在5000rpm下离心15min，取上清液（提取液）。留出1ml备用，准确量取剩余上清液体积。2、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。留出1ml备用，准确量取剩余上清液体积。3、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，得到SOD酶液。留出1ml备用，准确量取剩余上清液体积4、SOD酶活性测定1）将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。SOD活力测定加样程序见表：试剂空白管OD1OD2对照管SOD提取液SOD粗酶液SOD酶液A液/mL3.003.003.003.003.00SOD液/mL000.10.10.1蒸馏水/mL2.001.801.71.71.7室温放置20minB液/mL00.20.20.20.2OD值2）加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值（OD）结果1、酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）5/0.1 (1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度 纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液(