兽用抗菌药物耐药性风险评估-9-5.ppt

兽用抗菌药物耐药性风险评估 沈建忠吴聪明中国农业大学动物医学院 2007年9月甘肃兰州 报告内容 一 开展耐药性风险评估的必要性二 耐药性风险评估程序和方法三 国外耐药性风险评估开展情况四 我国耐药性风险评估开展情况及未来工作建议 养殖业的持续发展离不开抗菌药物 但广泛使用抗菌药物不仅带来了兽药残留问题 也带来了耐药性问题 严重威胁食品安全及人类健康 一 开展耐药性风险评估的必要性 耐药菌和耐药基因的生态网络 WolfgangWitte Science vol279 1998 食品动物 住院病人 社区居民 肉产品 粪便 动物饲料 种植作物 粪便 选择压力 主要宿主 污水 地表水 泥浆 食品 促生长预防治疗用抗生素 预防治疗用抗生素 阿伏帕星在1974被欧盟批准用于促生长剂后 导致猪 鸡体内广泛流行携带vanA基因的耐万古霉素肠球菌 而且耐药肠球菌可通过接触感染养殖人员及屠宰加工人员 也可通过肉品污染传递给社区健康人群 丹麦和英国90年代爆发的耐氟喹诺酮类沙门氏菌DT104感染 调查表明耐药菌分别来源于猪场和奶牛场 Kassenborg等调查美国的氟喹诺酮类耐药弯曲杆菌感染 发现感染者多食用过鸡肉或火鸡肉 且这些鸡场都有使用恩诺沙星的经历 台湾2002年采用分子亚型方法调查人耐氟喹诺酮沙门氏菌感染 发现猪是感染源 进一步调查证明 猪用氟喹诺酮后 其体内病原菌产生了对氟喹诺酮的耐药性 美国Donabedian等2003年从人和超市鸡肉分离到PFGE图谱完全一致的庆大霉素耐药肠球菌 说明耐药菌可通过食物链传递到人 WHO OIE等国际组织高度关注动物使用抗菌药物对食品安全和人类健康的影响 多次召开专家讨论会 制定了 关于控制食用动物抗生素耐药性的全球导则 动物源耐药菌对公共卫生潜在影响的风险评估方法 等系列文件和指南 倡导对食品动物谨慎使用抗菌药物 建议成员国开展动物源病原菌耐药性监测 开展风险评估 TheMedicalImpactofAntimicrobialUseinFoodAnimals ReportofaWHOMeeting Berlin Germany 13 17October1997 UseofQuinolonesinFoodAnimalsandPotentialImpactonHumanHealth ReportofaWHOMeeting Geneva Switzerland2 5June1998 WHOGlobalPrinciplesfortheContainmentofAntimicrobialResistanceinAnimalsIntendedforFood Geneva Switzerland5 9June2000 Monitoringantimicrobialusageinfoodanimalsfortheprotectionofhumanhealth ReportofaWHOconsultation Oslo Norway10 13September2001 JointFirstFAO OIE WHOExpertWorkshoponNon humanAntimicrobialUsageandAntimicrobialResistance Scientificassessment Geneva Switzerland1 5December2003 SecondJointFAO OIE WHOExpertWorkshoponNon HumanAntimicrobialUsageandAntimicrobialResistance Managementoptions Oslo Norway15 18March2004 基于预防原则 欧盟自2006年1月1日起 全面禁止食品动物使用抗生素促生长剂 美国虽不主张食品动物全面禁用抗菌药物添加剂 但也加强了食品动物使用抗菌药物对食品安全和人类健康的风险评估 其对养禽业使用恩诺沙星引起人氟喹诺酮类耐药弯曲杆菌感染的高风评价结果 促使FDA于2000年撤消了恩诺沙星的使用 欧盟 美国 澳大利亚 加拿大 日本等已建立了动物源病原菌耐药性监测国家系统 获得了大量科学数据并进行风险评估 2003 2005年国家食品污染监测网数据显示 我国动物性产品中沙门氏菌耐药率已高达58 多重耐药达33 耐10种以上药物的菌株达5 6 严重威胁人体健康 2005年鸡源大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药率已超过80 近年来人医和兽医耐药性调查结果表明 我国已成为世界上耐药性最严重的国家之一 严重的耐药性局面是否与我国养殖业长期广泛应用抗菌药物尤其是亚治疗剂量抗菌促生长剂有关 动物源耐药菌 耐药基因的广泛流行是否给食品安全和人类健康带来风险 这些问题 均需通过耐药性的广泛调查研究及风险评估来回答 但至今我国尚缺乏完善的动物源病原菌耐药性监测网 没有充分 可靠的数据支撑耐药性风险评估的开展 抗菌药物是我国规模化养殖不可或缺的物质 在缺乏充分风险评估的前题下 我们不可能采取欧盟全面禁用的做法 加强耐药性基础研究 完善监测网络调查动物源病原菌抗菌药物耐药性 建立规程开展兽用抗菌药物风险评估 成为了目前亟待解决的问题 开展耐药性风险评估 权衡风险和利益 科学管理和使用兽用抗菌药物 不仅可促进畜牧业的持续健康发展 而且可保障食品安全和人类健康 二 耐药性风险评估程序和方法 风险分析是当前广泛应用的食品安全和公共卫生安全宏观管理方法 兽用抗菌药物耐药性风险评估是利用风险分析技术和原理 对养殖业使用抗菌药物产生耐药性 耐药基因通过食物链暴露于人产生负面影响和潜在不良作用的科学评价 就兽用抗菌药物耐药性风险评估问题 WHO CAC和OIE多次召开专家讨论会 并制定了风险分析框架性文件 JointFAO OIE WHOExpertWorkshoponNon HumanAntimicrobialUsageandAntimicrobialResistance Scientificassessment Geneva December1 5 2003OIEInternationalStandardsonAntimicrobialResistance 2003 GuidelineonRiskAnalysisMethodologyforthePotentialImpactonPublicHealthofAntimicrobialResistantBacteriaofAnimalOrigin 释放评估描述动物应用抗菌药物导致耐药菌 耐药基因出现的概率 暴露评估描述人体通过特定途径暴露于耐药菌 耐药基因的概率 后果评估描述人体暴露于特定耐药菌 耐药基因后引起不良后果的概率 综合风险估计释放 暴露和后果评估结果整合 危害鉴定 特征描述 风险评价 耐药性风险评估程序 危害识别 对动物应用特定抗菌药物诱导的耐药菌的识别 对动物应用特定抗菌药物产生耐药因子 耐药基因及其载体 的识别 危害识别必须考虑抗菌药物的类型以及病原菌的亚型和血清型 动物饲料 肉 直接接触 医院 人类 屠宰加工厂 加工 食品动物 羊 奶牛 猪 家禽 肉牛 残渣 伴侣动物 植被 作物 水果 污水 养殖污水及粪便排放 动物饮用水 人饮用水 海洋 湖泊 游泳 水产 河流 溪水 企业 家用抗菌药物 其他家畜 社区 城市 农村 野生动物 土壤 烹饪制作消费 储存 耐药性流行病学 释放 暴露 后果 释放评估 描述动物应用抗菌药物导致耐药菌 耐药基因出现的概率暴露评估 描述人体通过特定途径暴露于耐药菌 耐药基因的概率后果评估 描述人体暴露于特定耐药菌 耐药基因后引起不良后果的概率 耐药性给人类健康带来危害的途径及风险评估 危害 治疗无效 抗菌药物治疗 耐药菌感染 抗菌药物用于动物 筛选出耐药菌 耐药基因 耐药菌 耐药基因扩散 屠宰加工过程耐药菌污染 零售食品中存在耐药菌 耐药菌被人体摄入的概率 释放评估 应用抗菌药物的动物种类 数量及其地理分布 应用抗菌药物数量 给药途径和方法 抗菌药物药效学 药动学 应用抗菌药诱导的耐药菌种类 耐药性的产生机制及传递机制 和其他抗菌药的交叉耐药性和 或协同耐药性 对动物 动物性产品以及排泄物中是否存在耐药菌的监控 描述动物应用某种抗菌药物后向特定环境释放耐药性菌或耐药因子的生物学途径 并定性或定量评价全过程发生的概率 可能需要的资料包括 暴露评估 描述人暴露于使用某兽用抗菌药物诱导产生的特定耐药菌或耐药因子的生物学途径 并用定性或定量方法对暴露发生的概率进行评估 可能需要的信息 人口学及包括传统和习俗在内的食物消费方式 被耐药菌污染的动物及其产品的流通 被耐药菌污染的动物饲料的流通 动物产品处理过程 包括屠宰 加工 储存 运输和销售 中耐药菌的存活能力及重新分布 被耐药菌污染食品中微生物的生长 对动物排泄物处理及人类暴露于排泄物中耐药菌或耐药因子的机会 耐药菌在人体肠道菌群中存活的能力 耐药菌在人与人之间的不自觉传播 耐药菌向其他共生菌转移耐药因子的能力 用于治疗人类疾病的抗菌药种类和数量 人类疾病治疗时间的长短及给药途径 剂量 药物 代谢 动力学因素 新陈代谢 生物利用率 能否作用于肠丛菌 后果评估 描述特定人群暴露于特定耐药菌或耐药因子及其暴露后果之间关系的 并对其发生的可能性进行评估 评估可以是定性的 也可以是定量的 耐药菌 耐药因子及其危害之间的量 效关系 人群易感性的变化 由于抗菌药失效而导致的人体健康效应的变化和发生频率 由于抗菌药可信度的降低而导致了人类医药实践的改变 由于对食品信任度的丧失以及相关联的次要风险 人们的饮食方式发生的改变 与上述后果相关的各种消费 与人类经典抗菌药治疗发生的冲突 可预测的药物未来状况 与时间相关 风险估计 患病人数及感染耐药菌株的比例 感染疾病和严重性及病程 感染死亡数量 每年死亡总数 每年的可能死亡数 随机人口的寿命或对耐药菌暴露较多的特定人群的寿命 靶微生物感染病理学的重要变化 在人体内观察到的耐药性水平 其他抗菌素治疗的缺乏情况 对于不同风险效应的权重加的某些随机的影响范围 例如 疾病和就医 三 国外耐药性风险评估开展情况 欧盟 Guidelineonpre authorizationstudiestoassessthepotentialforresistanceresultingfromuseofantimicrobialveterinarymedicinalproductsEMEA CVMP 244 01 EuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProducts日本 GuidelinefortheRiskAssessmentMethodologyfortheImpactonFoodSafetybytheAntimicrobialResistantOrganismsDerivedfromFoodAnimals Japan FoodSafetyCommission September30th 2004澳大利亚 Part10ofVeterinaryRequirementSeries SubmissiontoWorkingPartyonAntibiotics NationalRegistrationAuthorityforAgriculturalandVeterinaryChemicals June2000美国 Guidanceforindustry 152EvaluatingtheSafetyofAntimicrobialNewAnimalDrugswithRegardtoTheirMicrobiologicalEffectsonBacteriaofHumanHealthConcern U S DHHS FDA CVMOctober30 2003加拿大 GuidanceforIndustryPreparationofVeterinaryNewDrugSubmissions VeterinaryDrugsDirectorateHealthCanada March2007 已制定耐药性风险评估规程或指南的国家 VDD2 1 Guidance152 CVMP644 Part10 FSCGuideline 全球耐药性风险评估 OIE 已开展的针对特定病原菌耐药性风险评估的抗菌药物 阿伏帕星 avoparcin 肠球菌 Enterococcus 欧盟 肯定性结果 氟喹诺酮类 fluoroquinolone 弯曲菌 Campylobacter 美国 肯定性结果 链阳菌素类 Streptogramin 屎肠球菌 美国 否定性结果 大环内酯类 Macrolides 弯曲菌和肠球菌 美国 否定性结果 四 我国耐药性风险评估开展情况及未来工作建议 发达国家兽用抗菌药物耐药性风险评估方兴未艾 国内这方面的研究刚刚起步 近几年在国家自然科学基金 国家科技攻关计划 国家科技支撑计划资助下 中国农业大学 中国兽药监察所 华南农业大学 解放军农牧大学 四川农业大学等多家单位在耐药分子机制 耐药菌 耐药基因流行病学等方面开展了广泛研究 为耐药性风险评估工作的开展奠定了一定的基础 不同年代动物源大肠杆菌耐药性的调查 不同年代大肠杆菌耐药率的变化趋势 动物源病原菌耐药流行病学研究 不同年代大肠杆菌多重耐药的变化趋势 不同年代大肠杆菌耐药谱 CIP 环丙沙星 NOR 诺氟沙星 LMF 罗美沙星 AMP 氨苄西林 AMO 阿莫西林 NAL 萘啶酸 CEF 头孢噻吩 TET 四环素 CRO 头孢曲松 STP 链霉素 KAN 卡那霉素 AMK 阿米卡星 GEN 庆大霉素 EFX 恩诺沙星 CHL 氯霉素 FFN 氟苯尼考 OFL 氧氟沙星 SXT 复方新诺明 SMZ 磺胺异甲基恶唑 DAN 达氟沙星 DOX 多西环素 LOM 洛美沙星 CFZ 头孢唑林 OXY 土霉素 COL 多黏菌素 SD 磺胺嘧啶 SMD 磺胺对甲氧嘧啶 我国部分地区分离动物源大肠杆菌的耐药性监测 CIP 环丙沙星 NOR 诺氟沙星 LMF 罗美沙星 AMP 氨苄西林 AMO 阿莫西林 NAL 萘啶酸 CEF 头孢噻吩 TET 四环素 CRO 头孢曲松 STP 链霉素 KAN 卡那霉素 AMK 阿米卡星 GEN 庆大霉素 EFX 恩诺沙星 CHL 氯霉素 FFN 氟苯尼考 OFL 氧氟沙星 SXT 复方新诺明 SMZ 磺胺异甲基恶唑 DAN 达氟沙星 DOX 多西环素 LOM 洛美沙星 CFZ 头孢唑林 OXY 土霉素 COL 多黏菌素 SD 磺胺嘧啶 SMD 磺胺对甲氧嘧啶 我国部分地区离大肠杆菌体外药敏试验结果 北京 河南地区大肠杆菌多重耐药情况 内蒙呼和浩特地区乳源大肠杆菌多重耐药情况 内蒙呼和浩特地区154株乳源金葡菌的药敏试验结果 金黄色葡萄球菌流行病学调查研究 内蒙古呼和浩特地区154株乳源金葡菌多药耐药情况 大肠杆菌耐药性分子流行病学调查研究 北京地区牛源大肠杆菌流行的 型整合子及携带的耐药基因盒 北京地区牛源大肠杆菌 型整合子的各种流行形式 牛源大肠杆菌中以A类 型整合子最流行 占检出菌的92 D类次之 占检出菌的54 多数菌株存在两种 型整合子共存同一宿主菌的情况 其中以A D组合最多 占检出菌的54 该猪场大肠杆菌 型整合子流行普遍 检出率达54 7 其中以 型整合子D最流行 检出率达42 8 两种 型整合子共存同一宿主菌的情况 以A C组合最多 检出率达15 2 华南地区某猪场大肠杆菌流行的各种 型整合子及携带的耐药基因盒 华南地区某猪场大肠杆菌 型整合子的8种流行组合 1 4泳道 鸡分离大肠杆菌 5 9泳道 饲养员分离大肠杆菌 10 20泳道 环境分离大肠杆菌 Marker LambdaladderDNAstandard 华南地区某鸡场人源 鸡源及环境源多重耐药大肠杆菌的PFGE图谱分析 鸡源株 2 饲养员源株 7 8 9 和环境源株 20 属于同一PFGE分型的不同亚型 存在亲缘关系 表明养殖场动物 环境及饲养员之间存在多重耐药大肠杆菌的垂直传播 调查鸡源大肠杆菌耐药性过程中从120株菌中筛选出17株喹诺酮类耐药株 以qnr基因引物PCR扩增 获得3株阳性菌 序列测定结果显示3株菌的qnr基因同源性为100 与GenBank注册qnr基因序列 AY655485 同源性为95 3 3株qnr阳性菌对16 19种抗菌药物呈高水平多重耐药 我国鸡源大肠杆菌喹诺酮耐药株中qnr基因的发现 qnr基因序列同源性比较 大肠杆菌对氟苯尼考耐药机制的研究 图aHPLC法测定氟苯尼考在野生敏感菌和耐药菌内的聚集耐药菌株C260 C262 和敏感菌株C305 ATCC25922 对氟苯尼考的积聚量 图bHPLC法测定氟苯尼考在基因工程敏感菌和耐药菌内的聚集基因工程菌株JM109 和JM109 R 对氟苯尼考的积聚量 动物源病原菌耐药机理的研究 抗体对细菌内药物蓄积量的影响 鸡毒支原体大环内酯类抗生素耐药分子机理研究 大肠杆菌GenBank登录号为J01695 随机挑取的3株BG44T EMr 2株的rrnA发生了A2058G突变 但rrnB未发生任何突变 1株的rrnA未发生任何突变 而rrnB发生了G2057A A2059G突变 鸡毒支原体红霉素 替米考星 泰乐菌素诱导耐药株23SrRNA基因V域部分核苷酸序列分析比较 鸡毒支原体诱导耐药株MIC及其23SrRNA基因V域碱基突变 a按大肠杆菌23SrRNA核苷酸序列编号 b括号内数字为在该位置发生碱基替换突变的突变数 检测FloR1蛋白的间接竞争ELISA标准曲线 用间接竞争ELISA法建立检测FloR1蛋白的标准曲线 标准曲线在6 25ng ml 200ng ml之间 呈良好的线性相关 OD值与浓度 LogC 母液为1mg ml 之间的线性回归方程为 y 0 1744Ln x 1 1563 相关系数R2 0 9979 耐药性检测方法研究 大肠杆菌氟苯尼考耐药临床株间接竞争ELISA检测方法的建立 临床氟苯尼考耐药大肠杆菌ELISA检测及细菌体内FloR1蛋白含量的测定 图aMICs和FloR1蛋白量的线性关系图 图bMICs和OD值的线性关系图 通过数据分析得出 无FloR1蛋白抑制时平均OD值减去3倍标准偏差 OD 0 8879 或对应的蛋白浓度 3 04ng mL 可作为临界点来筛选临床细菌是否含有floR基因以及是否对氟苯尼考耐药 该方法能在2 3小时内确定细菌是否耐药 与常规的药敏试验相比 能快速简便地对细菌耐药性进行监测 发表的相关论文 WuB XiaC DuX CaoX ShenJ Influenceofanti FloRantibodyonflorfenicolaccumulationinflorfenicol resistantEscherichiacoliandenzyme linkedimmunosorbentassayfordetectionofflorfenicol resistantE coliisolates JClinMicrobiol 2006Feb 44 2 378 82 WangZ ShenJ SuoX ZhaoS CaoX Experimentallyinducedmonensin resistantEimeriatenellaandmembranefluidityofsporozoites VetParasitol 2006Jun15 138 3 4 186 93 Epub2006Mar9 WuCM WuH NingY WangJ DuX ShenJ InductionofmacrolideresistanceinMycoplasmagallisepticuminvitroanditsresistance relatedmutationswithindomainVof23SrRNA FEMSMicrobiolLett 2005Jun15 247 2 199 205 DuX ShenZ WuB XiaS ShenJ Characterizationofclass1integrons mediatedantibioticresistanceamongcalfpathogenicEscherichiacoli FEMSMicrobiolLett 2005Apr15 245 2 295 8 DuX XiaC ShenJ WuB ShenZ