中药清热利湿饮对 HaCaT 细胞表达 IL-6mRNA、IL-8mRNA、IL-10mRNA 及分泌 IL-8、IL-10 的影响_范玉_.pdf

以上病案均是先抓主证而后立方 正是经方 有是证 用是方 的体现 2 重视体质 陆师临床在抓主证的 同时 亦重视体质论治 他认为体质是先天禀赋和后天 获得 表现为人体对某些病因和疾病的易感性 以及疾 病传变转归中的某种倾向性 对机体疾病发生 发展和 临床治疗有着重要的影响 细读张仲景 伤寒杂病论 收稿日期 2013 09 03 基金项目 国家自然科学基金青年基金项目 81202700 H2709 国家中 医药管理局科研专项 04 05LP32 作者简介 范玉 1979 女 山东高密人 主治医师 博士研究生 研究 方向 中西医结合临床 皮肤性病学 有 汗家 湿家 失精家 素盛今瘦 强人 羸人 尊荣人 骨弱肌肤盛 等描述 这些均为体质的描写 对处方用药有指导作用 仲景是辨证结合体质论治疾 病 如案一中患者体型瘦小 体质柔弱 面色偏白 皮肤 细腻 平素怕风 怕冷 冬日易生冻疮 此为虚寒体质的 表现 这是适合运用桂枝类方的指征 故治疗以甘温立 法而愈 案 2 中患者素盛今瘦 脾胃素虚 不能运化水 饮 故现痰饮诸症 而以温化之法显效 陆师指出 临证 必须抓住主证 结合体质辨证 灵活加减化裁 才能更好 发挥经方的疗效 参考文献 1 朱世增 刘渡舟论伤寒 M 上海 上海中医药大学出版社 2008 实验研究 DOI 10 13192 j issn 1000 1719 2014 03 081 中药清热利湿饮对 HaCaT 细胞表达 IL 6m NA IL 8m NA IL 10m NA 及分泌 IL 8 IL 10 的影响 范玉1 杜锡贤1 张春红2 1 山东中医药大学附属医院皮肤科 山东 济南 250011 2 山东大学第二医院皮肤科 山东 济南 250033 摘要 目的 揭示中药清热利湿饮对人永生化角质形成细胞 HaCaT 细胞表达 IL 6m NA IL 8m NA IL 10m NA 和分泌 IL 8 IL 10 的作用机制 方法 以 HaCaT 细胞为研究对象 分别采用 T PC 技术及 ELISA 方法观 察中药清热利湿饮提取液对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞表达 IL 6m NA IL 8m NA IL 10m NA 和分泌 IL 8 IL 10 的影响 结果 清热利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞 IL 6m NA 和 IL 8m NA 的表达有下调作 用 在药物浓度为 10g L 和 12 5g L 时 HaCaT 细胞 IL 10m NA 的表达量增强较为明显 与 TNF 诱导活化组相比 有显著性差异 P 0 05 或 P 0 01 清热利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞 IL 8 的分泌有不同程度的抑 制作用 但对 IL 10 的影响不明显 结论 清热利湿饮可下调 IL 6m NA IL 8m NA 的表达 上调 IL 10m NA 的表 达 且此作用随药物浓度的升高而增强 同时可降低细胞 IL 8 的分泌 但对 IL 10 的分泌无明显的作用 关键词 清热利湿饮 HaCaT 细胞 IL 6 IL 8 IL 10 中图分类号 285文献标志码 A 文章编号 1000 1719 2014 03 0570 04 Effects of Traditional Chinese Medicine Qingre Lishi Yin on Expressions of IL 6m NA and IL 8m NA and IL 10m NA and Secretion of IL 8 and IL 10 in HaCaT Cells FAN Yu1 DU Xixian1 ZHANG Chunhong2 1 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine Ji nan 250011 Shandong China 2 The Second Hospital of Shandong University Ji nan 250033 Shandong China Abstract Objective To reveal the mechanism of traditional Chinese medicinal Qingre Lishi Yin on the expressions of IL 6m NA IL 8m NA IL 10m NA and secretion of IL 8 IL 10 in HaCat cells Methods Using HaCaT cell as the research object respectively to observe the effect of Qingre Lishi Yin extraction of IL 6m NA IL 8m NA IL 10m NA and the secre tion of IL 8 IL 10 solution on the expression of activation HaCaT cells induced by TNF through T PC and ELISA e sults Qingre Lishi Yin could downregulate the expressions of IL 6m NA and IL 8m NA of HaCaT cells induced by TNF In the drug concentration for 10g L and 12 5g L the expression of IL 10m NA increased significantly and activated by TNF group there was significant difference P 0 05 and P 0 01 Qingre Lishi Yin on HaCaT cell induced by TNF IL 8 activa tion had different degrees of inhibition of secretion but no obvious effect on IL 10 Conclusion Qingre Lishi Yin can reduce the expressions of IL 6m NA IL 8m NA up regulate the expression of IL 10m NA and this effect increases with the concen tration increasing at the same time it can reduce the secretion of IL 8 cells but no obvious effect on IL 10 secretion Key words Qingre Lishi Yin HaCaT cell IL 6 IL 8 IL 10 075 辽宁中医杂志 2014 年第 41 卷第 3 期 银屑病是一种常见的易于复发的慢性炎症性皮肤 病 典型皮损为红斑 鳞屑 其发病原因及发病机理复 杂 至今尚未完全阐明 清热利湿饮是本院皮肤科的 内服协定中药方 临床应用多年 因其疗效显著 安全 性高深受广大患者欢迎 为探讨清热利湿饮对角质形 成细胞是否有直接作用 及银屑病与相关基因和相关 炎性细胞因子的关系 笔者以 TNF 刺激活化的 HaCaT 细胞作为银屑病角质形成细胞过度增殖的体外 模型 试图从基因水平探索清热利湿饮对银屑病的作 用机制 1材料和方法 1 1材料 1 1 1细胞永生化人类角质形成细胞 HaCaT 细 胞 购于武汉大学中国典型培养物保藏中心 1 1 2主要试剂及耗材DMEM 高糖培养基 美国 GIBCO 公司 胎牛血清 FBS 杭州四季青生物公 司 胰蛋白酶 美国 Sigma 公司 T PC 试剂盒 人 IL 8 ELISA 试剂盒 D 公司 人 IL 10 ELISA 试剂盒 D 公司 琼脂糖 电泳级 美国 Sigma 公 司 rhTNF PEP OTECH 公司 10 g 支比活 2 107U mg 蒸馏水溶解 10 mg L 2 108 U L 20 冻存备用 1 1 3主要仪器SW CJ IF 型超净工作台 MCO 150A 型 CO2培养箱 日本 Sanyo 公司 TS300 倒置 显微镜 日本 Nikon 公司 Heraeusvarifuge 3 O S 型 台式高速离心机 流式细胞分析仪及软件 B D 公 司 EC250 90 多功能电泳仪 美国 EC 公司 ZF 4 型多功能紫外投射反射分析仪 上海长明光学电子 仪器厂 PTC 150 型 PC 扩增仪 美国 MJ esearch 公司 1 D Image Analysis Software 凝胶分析系统 美 国 Kodak 公司 Biorad550 酶标仪 Biorad 公司 人 IL 8 ELISA 试剂盒 D 公司 人 IL 10 ELISA 试 剂盒 D 公司 1 1 4药物清热利湿饮由金银花 30 g 土茯苓 30 g 龙胆草 9 g 黄芩 9 g 栀子 9 g 紫草 15 g 连翘 15 g 生地黄 15 g 牡丹皮 15 g 赤芍 15 g 板蓝根 30 g 车前 子 15 g 泽泻 9 g 当归 9 g 柴胡 9 g 甘草 9 g 组成 采用甲氨喋呤 MTX 作为阳性对照药 注射用甲 氨喋呤 取 DMEM 培养液配制成1 g L 20 冻存备 用 rhTNF PEP OTECH 公司 10 g 支比活 2 107U mg 蒸馏水溶解 10 mg L 2 108U L 20 冻存备用 1 2方法 1 2 1中药提取液的制备精确称定上述中药药材 加 10 倍量的水浸泡 30 min 煎煮开锅后继续煎煮 45 min 过滤药液待用 将药渣加 8 倍量的水同法煎煮 30 min 过滤 合并两次的滤液 用 65 乙醇醇沉 24 h 回收乙醇至无醇味 浓缩至每 mL 相当于原药材 2 g 的 清热利湿饮水提液 0 22 m 超滤膜过滤除菌 4 冰 箱冷藏保存备用 细胞培养时用无血清 DMEM 培养液 配制成不同浓度 并将其 pH 值调到 7 0 1 2 2IL 6m NA IL 8m NA 和 IL 10m NA 的 测定 查找 IL 6 IL 8 IL 10 的引物序列 并确 定作为内参的 actin 的引物序列 以 actin 为内 参照 引物设计如下 见表 1 表 1 IL 6 IL 8 IL 10 及 actin 的引物序列 引物序列产物长度 IL 6上游引物5 atgattgacaaacaaattcgg 3 531bp 下游引物5 ttacatttgccgaagag 3 IL 8上游引物5 atgacttccaagctggccgtg 3 293bp 下游引物5 tctcagccctcttcaaaaacttctc 3 IL 10上游引物5 gtggcgccccaggcacca 3 249bp 下游引物5 ctccttaatgtcacgcacgattt 3 actin 上游引物5 gtg ggg cgc ccc agg cac ca 3 539bp 下游引物5 ctc ctt aat gtc acg cac gat ttc 3 取对数生长期的 HaCaT 细胞常规消化后接种 于 100 mL 细胞培养瓶中 细胞浓度为 1 107 L 37 体积分数为 5 CO2孵箱孵育过夜 使其贴壁 次 日加入 TNF 终浓度为 2 5 105 L 常规培养 24 h 后分别加入 MTX 和清热利湿饮提取液 MTX 终浓度 为 5 mg L 清热利湿饮提取液浓度分别为 12 5 g L 10 g L 7 5 g L 和 5g L 常规培养 48 h 后 弃上清 PBS 洗一次 用胰酶消化5 min 加入 PBS 轻轻吹打 获 取单个细胞悬液 吸入 50 mL 离心管中 1000 r min 10 min 离心 弃上清 加入 PBS 将细胞吸入 2 mLEP 管中 5000 r min 5 min 离心 弃上清 20 冻存备 用 实验所用物品均进行去 Nase 处理 组织 及细胞总 NA 的提取 逆转录 T 反应于经 DEPC 处理过的 0 5 mL Ep 管中加入表 2 所示试剂 表 2逆转录 T 反应体系 试剂名称用量 细胞总 NA 1 g M MLV1 L 5 T buffer4 L 0 1mol DTT2 L 4 dNTP1 L 随机引物1 L 去 Nase 水补至 20 L 快速离心混匀 37 1h 95 10 min 灭活 M MLV 快速离心使蒸汽沉于管底 聚合酶链反应 PC 在上述5 L T 产物的0 5 mL Eppendorf 管中 继续加入表 2 所示试剂 快速离心混匀 95 5 min 冰浴冷却 然后快速离心使蒸汽沉于管底 加入 1 L 1 U L Taq DNA 聚合酶 快速离心混匀 加入 30 L 液体石蜡 循环条件 94 1 min 58 1 min 72 1 min 共35 个循环 最后72 延长7 min 电泳鉴 定 定量分析 将凝胶电泳图像输入美国 Kodak 凝 胶分析系统 应用 1 D Image Analysis Software 进行表 达强度分析 按下公式计算相对系数 相对系数 细胞因子表达强度 actin 表达强度 1 2 3IL 8 和 IL 10 的测定 细胞培养上清收 集 取对数生长期的 HaCaT 细胞用胰酶消化 加入吹 打成单个细胞悬液 吸入 50 mL 塑料离心管中 1000 175 辽宁中医杂志 2014 年第 41 卷第 3 期 r min 10 min 离心 弃上清 CM 重悬细胞 调细胞浓 度为 1 107 L 分别取 1 5 mL 细胞悬液加入 24 孔细 胞培养板中 37 体积分数为 5 CO2孵箱孵育过 夜 使其贴壁 次日加入 TNF 终浓度为 2 5 105 L 常规培养 24 h 后分别加入 MTX 和清热利湿饮提 取液 MTX 终浓度为 5 mg L 清热利湿饮提取液终浓 度分别为 15 g L 12 5 g L 10 g L 7 5 g L 和 5 g L 常规培养 48 h 吸取各孔培养上清 1 mL 分别冻存于 20 备测 为了避免药物在培养上清中可能对 ELISA 方法所测定的结果产生干扰 本研究将药物作 用 48 h 后的细胞培养上清弃去 在原孔重新补充无药 物的培养基 继续培养 48 h 收集上清 48h 换液组 进 行测定 ELISA 测定 采用夹心 ELISA 检测试剂盒 按说明书操作 2结果 2 1清热利湿饮提取液对 HaCaT 细胞表达 IL 6m NA IL 8m NA 和 IL 10m NA 的影响 采用 T PC 技术检测清热利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞 IL 6m NA IL 8m NA 和 IL 10m NA 表达的影响 图 1 图 4 显示 清热 利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞产生的 炎性细胞因子 IL 6m NA 和 IL 8m NA 的表达有下 调作用 且呈一定的剂量依赖关系 图 5 图 6 显示 清热利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞 IL 10m NA 的表达有上调作用 且药物浓度在 10 g L 和 12 5 g L 时对 IL 10 m NA 的表达量增强较为明 显 与 TNF 诱导活化组相比 有显著性差异 P 0 05 和 P 0 01 图 1 IL 6m NA 在 HaCaT 细胞中表达的 凝胶电泳图谱 M 1kb DNA Marker 注 1 空白对照组 2 TNF 组 3 MTX 组 4 中药 5g L 组 5 中药 7 5g L 组 6 中药 10g L 组 7 中药 12 5g L 组 图 2 IL 6 m NA 表达 图 3 IL 8m NA 在 HaCaT 细胞中表达的 凝胶电泳图谱 M 1kb DNA Marker 注 1 空白对照组 2 TNF 组 3 MTX 组 4 中药 5g L 组 5 中药 7 5g L 组 6 中药 10g L 组 7 中药 12 5g L 组 图 4 IL 8 m NA 表达 图 5 IL 10m NA 在 HaCaT 细胞中表达的 凝胶电泳图谱 M 1kb DNA Marker 注 1 空白对照组 2 TNF 组 3 MTX 组 4 中药 5g L 组 5 中药 7 5g L 组 6 中药 10g L 组 7 中药 12 5g L 组 图 6 IL 10 m NA 表达 2 2清热利湿饮提取液对 HaCaT 细胞分泌 IL 8 和 IL 10 的影响 采用 ELISA 方法检测 HaCaT 细胞培养上清中 IL 8 的浓度 表 3 显示 未经刺激的 HaCaT 细胞培养 275 辽宁中医杂志 2014 年第 41 卷第 3 期 24 h 48 h 和72 h 后 上清中 IL 8 的浓度为350 410 pg mL 经 TNF 诱导后 IL 8 的分泌明显升高 520 590 pg mL 而不同浓度的清热利湿饮对经 TNF 活化后的 HaCaT 细胞分别作用 24 h 48 h 和 72 h 后 IL 8 的分泌功能明显降低 且这种抑制效应 与药物浓度存在依赖关系 为了避免药物在培养上清 中可能对 ELISA 方法所测定的结果产生干扰 本研究 将药物作用 48 h 后的细胞培养上清弃去 在原孔重新 补充无药物的培养基 继续培养 48 h 收集上清 48 h 换液组 进行测定 结果 IL 8 的浓度与未换液前基本 相似 提示去除清热利湿饮 48 h 后 药物对 HaCaT 细 胞 IL 8 的分泌抑制功能依然存在 表 4 显示 不同 浓度的清热利湿饮对 HaCaT 细胞作用 24 h 48 h 和 72 h 与无药物细胞对照相比 HaCaT 细胞培养上清中 IL 10 的浓度虽然有所升高 但升高幅度较小 无统计 学差异 P 0 05 表 3HaCaT 细胞培养上清中 IL 8 的浓度 pg mL n 3 珋 x s 组别24 h48 h48 h 换液72 h 空白对照组352 08 75 22360 36 91 94331 49 196 33410 39 190 62 TNF 组522 20 295 01 562 50 149 52 532 83 251 24 593 40 253 21 MTX 组265 38 99 77 240 43 81 53 231 40 110 34 184 71 81 21 中药5 g L 组501 78 240 78422 55 142 35424 35 235 69364 22 126 32 中药7 5 g L 组430 43 119 88362 78 117 88373 49 97 88292 39 92 16 中药10 g L 组304 37 159 24 275 42 87 32 260 37 80 13 262 42 120 71 中药12 5 g L 组 240 51 73 54 203 09 73 56 204 29 90 95 183 71 70 35 中药15 g L 组103 08 74 87 152 24 85 89 182 34 99 78 151 40 104 56 注 与空白对照组比较 P 0 05 表 4HaCaT 细胞培养上清中 IL 10 的浓度 pg mL n 3 珋 x s 组别24 h48 h48 h 换液72 h 空白对照组40 11 10 9146 54 17 9945 26 20 3540 01 15 23 TNF 组42 29 17 32 40 52 20 3346 44 10 6550 25 20 69 MTX 组 26 23 9 5130 61 7 2124 21 10 2526 26 7 58 中药5 g L 组44 21 12 5150 32 13 2148 25 24 1250 05 16 32 中药7 5 g L 组51 39 7 1451 56 22 0952 01 13 5554 00 15 22 中药10 g L 组52 52 28 2154 36 9 2156 21 14 2160 65 7 33 中药12 5 g L 组53 02 18 2152 74 15 8860 56 10 8956 01 18 54 中药15 g L 组44 68 25 0150 54 10 8730 25 18 8848 25 16 22 3讨论 Bos 等 1 描述了银屑病皮损中 T 细胞 抗原递呈 细胞 APC 和角质细胞之间的相互关系 其中 T 细胞 局部活化在银屑病发病机制中起重要作用 活化的 T 细胞可分泌一系列细胞因子 这些细胞因子又刺激邻 近的细胞如单核巨噬细胞 角质细胞 内皮细胞等分泌 大量细胞因子 形成细胞因子级联放大作用 使银屑病 慢性迁延 白细胞介素 IL 简称白介素 主要由白细 胞 和其他细胞 产生 是细胞间发挥广泛炎症 刺激 活化作用的细胞因子 IL 6 由成纤维细胞 内皮细 胞和在各种病理情况下侵入皮肤的炎症细胞产生 其 在银屑病细胞因子网络中的主要作用是促使角质细胞 异常增生及刺激 T 细胞活化 Paquet 等 2 发现 银屑 病角质细胞比正常人角质细胞对 IL 6 的刺激更敏 感 免疫组化显示银屑病皮损表皮转化带上 IL 6 及 其受体的表达明显增强 且与斑块扩张的位置一致 最具特征的炎性细胞因子是 IL 8 其可吸引中性粒 细胞 嗜碱性粒细胞和 T 细胞作定向趋化运动 激活 中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 使之脱颗粒释放生物活性 介质 增强炎症和过敏反应 其在银屑病皮损中主要 来源于角质细胞及聚集在表皮中的中性粒细胞 3 在 细胞因子 IL 1 TNF IFN 和 GM CSF 刺激 下 皮肤宿主细胞及炎细胞均可产生 IL 8 使银屑病 皮损中 IL 8 及其 m NA 表达增强 IL 10 是由激 活的巨噬细胞 部分淋巴细胞和角质细胞产生的 18 KDa 细胞因子 主要生物活性是抑制 Th1 细胞分泌 IL 2 IFN 等细胞因子 下调细胞免疫应答 还可抑 制巨噬细胞功能 降低抗原递呈作用 减少单核因子生 成 有关 IL 10 的研究较少 但有研究表明银屑病皮 损中 IL 10 及其受体表达下降 4 某些细胞因子 如 IL 6 TNF IL 1a ET 1 等 在皮损局部的浓度 与 PASI 的关系表明 银屑病皮损中上述细胞因子浓度 增高是病情加重的信号 银屑病皮损中的细胞因子网 络极其复杂 尚需更深入的探讨 以便更精确地揭示银 屑病的免疫病理变化 本研究采用 T PC 技术检测清热利湿饮对经 TNF 诱导活化的 HaCaT 细胞 IL 6m NA IL 8m NA 和 IL 10m NA 表达的影响结果显示 清热利 湿饮对经 TNF 诱导 活 化 的 HaCaT 细 胞 IL 6m NA 和 IL 8m NA 的表达有明显下调作用 且呈 一定的剂量依赖关系 而对 IL 10m NA 的表达有上 调作用 且药物浓度在 10g L 和 12 5 g L 时对 IL