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DNA甲基化对基因表达的调控 吴立文 硕士九班 82101062134摘要DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，调节着机体许多生物学过程。DNA甲基化由DNA甲基转移酶催化，在多种调节因子的参与下，与组蛋白修饰相互作用，抑制基因转录，导致基因沉默。探讨DNA甲基化与基因转录抑制之间的关系，对许多人类疾病的研究具有重要意义。关键词 DNA甲基化；DNA甲基转移酶；转录抑制；肿瘤Abstract DNA methylation is an important epigenetic modifica-tion which regulates a number of biological processesDNA methylation catalyzed by DNA methyltransferases interacts with histone modification to inhibit gene transcription，induce gene silencing at the participation of many regula-torsDiscussing the relations of DNA methylation and gene transcriptional silencing takes on important significances for the study of many human diseasesKey words DNA methylation；DNA methyhransferases；transcriptional silencing; knub引言在真核细胞中，DNA甲基化使得胞嘧啶环5碳的位置添加一个甲基，这个发生在5-CG-3序列(也称作CpG二核苷酸)中的反应受DNA(5-胞嘧啶)甲基转移酶DNA(Cytosine-5)-methyltransferase，DNA MTase的催化。这是最常见的真核性DNA修饰。这种现象在植物和动物中都广泛存在，它在正常发育和组织特异的基因表达中起重要作用。基因的DNA序列只是一个模板，高等生物的每一个细胞都具有全套基因，即全能性(totipotency)。但构成生物体各组织的细胞类型却千差万别，这全能性的基因如何表达出如此多样性的细胞、组织?研究机体这一复杂、有序表达调控过程的分子生物学分支学科现被称为表观遗传学。表观遗传学最初是用来描述环境因素与基因相互作用进而产生表型(phenotype)的过程(Waddington CH，1942)，以后逐步衍化，目前有关表观遗传学的概念是指：“基因功能的改变凡未牵涉到DNA的序列，又可通过细胞的有丝或减数分裂而遗传者，称为表观遗传学”。表观遗传学指引起基因表达改变的遗传物质的变化，主要包括基因组和染色质(含组蛋白)的化学修饰，如甲基化、乙酰化、磷酸化等，它们可显著影响基因的表达谱。但这些化学修饰并不引起DNA序列的改变(无突变)，因此基本上是可逆的。且这些化学修饰在体细胞分裂、复制时以相当高的保真度传递给子代细胞，甚至可见于生殖细胞的遗传1。DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要方式之一，这种修饰作用发生在DNA复制之后、转录之前。它能通过影响基因的转录和染色体的构型而调控基因的功能，是生物体正常发育、分化所必需的，具有重要的生物学意义。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶上。真核细胞DNA甲基化的主要途径是胞嘧啶(C)在5位置上的甲基化反应，5-甲基胞嘧啶通常位于鸟嘌呤(G)的旁边，脊椎动物中，CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，人们将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛。在整个基因组中，CpG岛通常位于基因的启动子区域(promoter region)，在正常情况下，CpG岛是以非甲基化形式存在于基因的启动子内2。用限制酶进行分析的结果表明，在不转录的DNA中GC有70以上是甲基化的，而在表达活性高的DNA中，GC顺序只有2030是甲基化的，表明DNA甲基化作用确实是一种基因调控手段。催化胞嘧啶甲基化修饰的酶为DNA胞嘧啶甲基转移酶(cytosine methytransferases)，甲基供体为s-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine)。已经克隆、鉴定的哺乳动物DNA胞嘧啶甲基转移酶包括DNMT1、DNMT3(DNMT3a、DNMT3b)，目前认为，DNMT1的主要功能与DNA复制后新合成链相应位点的甲基化有关，由于复制后双链的CpG二核苷酸对成为半甲基化状态(hemimethylated sites)，DNMT1识别这些位点。并迅速催化其恢复为对称的甲基化状态，从而保持了可遗传的表达状态。DNMT3a、DNMT3b的主要功能可能与建立新的甲基化状态有关(de novo methylation)。事实上，DNA甲基化最初发现是作为宿主防御、抵抗外来入侵的病毒、寄生虫DNA的一种机制。以类似于RNAi的机制(胞浆的dsRNA介导的使其相对应的靶mRNA降解)，在胞核中不是使其相对应的靶mRNA降解，而是使其同源DNA甲基化(de novo methylation)，从而导致靶基因“沉默”3。一般说来，DNA甲基化与基因表达呈负相关，不仅启动子区高甲基化与基因表达呈负相关，基因内部的甲基化与基因表达也存在着弱的负相关，而启动子区低甲基化与转录活性正相关。在体外，已甲基化的序列转入细胞后可抑制表达，相反，许多内源基因在经甲基化抑制剂5-叠氮胞嘧啶处理后被激活。DNA甲基化调节基因的表达有三种可能的机制：5-甲基胞嘧啶伸入DNA双螺旋的大沟。从而影响转录因子的结合。序列特异的甲基化DNA结合蛋白(MDBP-l和MDBP-2)与甲基化的启动子序列特异性结合从而抑制转录因子与靶序列的结合。甲基化CpG结合蛋白(MeCP1和MeCP2)与甲基化的二核苷酸CpG结合，类似转录抑制蛋白的作用，MeCP1与甲基化DNA结合需要12个甲基化的CpG，MeCP2只需要一个甲基化的CpG，并且非常丰富。最近发现，启动子区DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化之间具有协同抑制基因转录的作用。具有转录活性和无转录活性的DNA表现许多不同的特点，包括染色质的紧密程度、启动子甲基化状态和组蛋白去乙酰化状况 。组蛋白N末端丝氨酸残基上的乙酰基突出于核小体影响DNA间的相互附着，使染色质处于开放状态，有利于基因的表达。启动子区甲基化的CpG能与甲基化CpG结合蛋白Mecps结合，Mecps募集了转录抑制因子Sin3和组蛋白去乙酰化酶后形成一个共同转录抑制因子，组蛋白去乙酰化酶使组蛋白去掉乙酰基，染色质变得更密集，从而阻碍了基本转录单位蛋白质复合物进入启动子结合位点，导致转录抑制。相反恢复基因的表达需要依次发生组蛋白乙酰化和DNA去甲基化。Faks等人通过实验证明了Dnmtl能直接与组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)结合，并确定了特异性结合位点，这一发现更直接地证明DNA甲基化与组蛋白去乙酰化之间的协同作用4。但是组蛋白去乙酰化抑制基因转录的作用依赖于甲基化CpG位点的数目。Currdi等在研究中发现，当发生甲基化改变的启动子区域的CpG位点的数量不足以引起长距离的基因抑制的时候，组蛋白去乙酰化在抑制基因表达上将发挥重要的作用。如当靠近启动子的地方仅有几个二核苷酸发生甲基化时，这些甲基化的CpG能提高甲基化胞嘧啶结合蛋白MBD的活性及与他们相联系的组蛋白去乙酰化酶HDAC的活性。此时，组蛋白发生去乙酰化，并使核小体的结构紧缩，于是转录抑制。在这种情况下，组蛋白去乙酰化的协同抑制发挥着决定性的作用，因为用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理可以使因甲基化而静止的基因恢复表达，抑制被解除。说明了甲基化所致的染色质结构的紧缩不够稳定，不足以维持这种紧缩的状态。因而在启动子区mCpG低密度的情况下，转录抑制主要归功于组蛋白去乙酰化途径。DNA甲基化是哺乳类动物遗传外修饰的重要调控方式，也是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式。它在基因突变，基因表达调控，细胞增殖、分化、发育，基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤发生和演进有密切联系。大量实验表明，在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的紊乱，DNA甲基化异常可通过影响染色 质结构以及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤的形成。因而研究DNA甲基化与肿瘤的关系成为当前分子生物学的热点之一5。肿瘤组织中存在着基因组普遍的低甲基化和局部区域的过甲基化现象，导致这种现象的原因还不清楚，但已经发现肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤形成上起着重要的作用。肿瘤抑制基因(p161NK4A)、肿瘤转移抑制基因(Ecadherin)、激素受体基因(雌激素受体基因、视黄酸受体基围)、DNA修复基因(错配修复基因hMLHI、各胱甘肽S转移酶基因GST3)和血管生成抑制基因(血小板反应蛋白基因)等启动子区的过甲基化都可使相应基因表达降低或不表达，进而促进肿瘤的形成。pl6INK4A编码一种依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶抑制剂，在控制细胞周期中具有重要作用，在肺癌、乳腺癌和结肠癌都发现了P 16启动子的过甲基化和P16蛋白表达异常。肿瘤转移抑制基因Ecadherin是一种细胞粘附分子，可抑制肿瘤细胞的浸润和转移，在乳腺癌、前列腺癌和胃癌的细胞系以及肝癌和胃癌的组织中都发现Ecadherin启动子区过甲基化现象，Yoshiura等用甲基化抑制剂处理Ecad表达阴性的细胞系，使Ecad恢复了表达。在肿瘤形成过程中，这些遗传外改变与遗传性改变(DNA序列改变)相互作用，最终形成肿瘤。例如，hMIH1、pl6INK4A、GST3的过甲基化引起的表达异常可分别通过微卫星不稳定性增加细胞绕过M0期和O2对DNA的损伤增加等导致遗传不稳定性增加，最终通过遗传性改变导致肿瘤的发生。一些在家族性癌中由于基因突变导致功能异常的基因，在散发性肿瘤中常表现为甲基化的异常6。利用这些特点，我们可以很好地利用DNA甲基化寻找新的抑癌基因通过鉴定因启动子CpG岛甲基化而失活的基因，可以有效地发现新的抑癌基因。1990年，在肿瘤研究报道中可以发生甲基化的启动子Cp6岛的数量是有限的。因此，一旦一个甲基化的启动子CpG岛被发现，它的下游区基因就被认为在肿瘤形成中发挥重要作用，此基因即被认为候选抑癌基因。但是现在认为在肿瘤中，可以发现许多CpG岛发生甲基化，比如，在AGS胃癌细胞系中，有42175个基因失活，而未必所有发生甲基化的CpG岛在肿瘤发生中都起作用，而且经常发现无意义的甲基化。为了避免假阳性，我们必须注意这个基因在正常细胞的表达是否有功能。然后我们把这个失活基因嫁接到无此基因表达的肿瘤细胞系，使此基因正常表达。如果此基因正常表达抑制了肿瘤细胞的生长，则证实这个基因是新型候选抑癌基因7。虽然人们对DNA甲基化的研究开展了大量的工作，但因为还不完全清楚发育控制的去甲基化、甲基化谱建立和维持的机制及作用方式等问题，还是有很多工作要做。真核细胞中多种多样后代调节现象的存在表明，不同后代调节的建立绝非单一因素所能控制，必然还要涉及其它许多因子。对这一领域研究结果的全面了解将有益于加深对基因表达调控机制的研究8。就家畜而言，DNA甲基化的研究多集中在总体甲基化水平与生长发育关系上，到底是哪些基因的甲基化水平发生变化、如何变化，还不太清楚。单个基因中，特定甲基化区域与基因表达的关系尚待深入研究。参考文献1 Turekplewa J，Jagodzinski P PThe role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expressionJCell Mol Biel Lett，2005，10(4)：631-6472 Ktose R J，Bird A PGenomic DNA methylation；the mark and its media-torsJTrends Biochem Sei，2006，31(2)：89-973 Gowher H，Liebert K。Hermann A，et a1Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B DNA (cytosineC5) methyhransferases by Dnmt3LJJ Bid Chem，2005，280(14)：l3341一l33484 Fuks FDNA methylation and histone modifications：teaming up to silen-ce geneJCurt Opin Gcnet Dev，2005，15(5)：490-495 5 陆娟，房静远，陈萦匝，等癌相关基因在结肠癌中的表达及其甲基化调控J肿瘤，2003，23(4)：2902936 张艳玲，肖文华，张艳