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基因诊断在传染病领域中的研究进展 陈 智 浙江大学医学院附属第一医院 美国自然遗传学杂志200年9月27日发表一项调查报告，列出了未来5至10年内最有希望为改善世界各国、特别是广大发展中国家人们的健康状况作出贡献的十大关键生物技术。这项调查综合了全球28位知名专家的看法，其中包括中国科学院基因组信息学中心暨北京华大基因研究中心杨焕明教授。报告执笔人之一、加拿大多伦多大学生物伦理学联合中心主任彼得辛格博士在接受新华社记者电话采访时说，这项为期5个月的调查由该中心具体负责组织实施，调查中采用了“德尔菲法”，通过反复征求专家的意见，最后根据在健康领域的重要性，为各项生物技术排出了优先次序。其中，位居第一的是针对传染病的分子诊断技术。在发展中国家，近一半的死亡病例由传染病所致，发展中国家现有的很多诊断技术存在着操作不便、费用高昂等缺陷，聚合酶链式反应、单克隆抗体等分子诊断技术如能得到更广泛的使用，进一步降低成本，将可以提高发展中国家传染病诊断的水平，使死亡率降低。 排列第二至第十位的生物技术分别为：利用基因工程手段开发重组疫苗的技术；除注射之外，更有效的药物和疫苗输送技术；利用微生物和植物等检测或清除污染的环保生物技术；病原体基因组测序技术；使妇女能有效防御性传播疾病的新技术；可用于识别药物靶标等的生物信息技术；营养价值更高、可对付营养不良的转基因作物技术；可降低激素、干扰素等治疗性蛋白质成本的转基因等技术；可有效促进新药研制开发的组合化学技术。 2000年6月26日人类基因组草图的公布，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。分子医学诊断技术的运用，将是二十一世纪人类医疗保健的重大进展。基因诊断虽然只有短短的20多年历史，但发展迅速，尤其是DNA测序、PCR技术、寡核苷酸探针杂交、DNA芯片、蛋白质芯片技术等。 一、基因诊断技术的发展与进步 所谓基因诊断，是采用现代分子生物学技术直接探查基因的存在和缺陷，从而对人体状态和疾 （1）以探测基因为目标，属于“病病作出诊断。与传统的诊断方法比较，基因诊断有以下几个特点： （2）由于检测因诊断”，针对性强。且由于其应用技术以分子杂交为基本原理，故有很高的特异性；技术十分敏感，故诊断灵敏度相当高；（3）由于基因探针或引物可为任何来源，任何种类，所以适应性强，诊断范围广；（4）在感染性疾病的基因诊断中，不仅可检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染；既能诊断普通菌株或病毒，也能检出变异株；同时，能对那些不容易体外培养（如产毒性大肠杆菌）和不能在实验室安全培养（如立克次体）的病原体作出诊断，所以大大扩大了诊断范围。近年来，基因诊断技术发展十分迅速，尤其是实时荧光定量 PCR 技术和基因芯片技术有了艽蟮慕梗谏镆窖煊颍静煊颍釉嚼丛酱蟮淖饔谩?（一）实时荧光定量 PCR 技术研究进展 57 所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术于 1996 年由美国Applied Biosystems 公司首先推出，不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 在荧光定量 PCR 技术中，有一个很重要的概念 Ct 值。C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图 1 所示）。 图 1. Ct 值的确定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold 10 SDcycle 6-15 研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图 2. 荧光定量标准曲线58 荧光定量 PCR 所使用的探针有许多种，现以 TaqMan 荧光探针为例将其原理简述如下：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的 5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。如图 3 所示。 59 图3 TaqMan 荧光探针工作原理 SYBR 荧光染料法进行实时荧光定量的原理和使用相对比较简单，只要在 PCR 反应体系中加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 （二）内标在定量 PCR 中的意义 1传统定量 PCR 方法主要有以下几种： 1）内参照法： 在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在 PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。 2）竞争法： 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化 PCR 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 3）PCR-ELISA 法： 利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高粱蛏锼孛副昕固澹备趸锩附岷衔铮钪彰甘沟孜锵陨娴?PCRELISA 法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。 2内标在传统定量中的作用 由于传统定量方法都是终点检测，即 PCR 到达平台期后进行检测，而 PCR 经过对数期扩增到60达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验，所得结果有很大差异（见图 4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 图 4. 相同模板在同一台 PCR 仪上进行 96 次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct 值则极具重现性 （三）内标对荧光定量 PCR 的影响 1实时荧光定量 PCR 无需内标 实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct 值是恒定的。（见图 4） 2）Ct 值与起始模板的线性关系 由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。 2内标对实时荧光定量 PCR 的影响 若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 61 美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。 （三）生物芯片 生物芯片技术是近年出现的 DNA 或蛋白质分析技术，其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化。高度的并行性不仅可大大提高实验的进程，并且有利于 DNA 芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读。多样性是指在单个芯片中可以进行样品的多方面分析，从而大大提高分析的精确性，避免因不同实验条件产生的误差。微型化是当前芯片制造中普遍的趋势，其好处是可以减少试剂用量和减小反应液体积，从而提高样品浓度和反应速率。高度自动化则可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动。由于这些优点，它成为后基因组时代基因功能分析的最重要技术之一。理论上，生物芯片可以同时检测多种病毒、细菌等微生物，而且可以鉴别菌株、亚型以及耐药性的方法。近年来，生物芯片在表达谱分析、微生物基因分型、菌种鉴定及重要基因（毒力基因、抗药基因、致病因子）筛选监测、直接分析细菌基因组进行菌种鉴定与流行病学研究中的应用有不少成功的报道，显示了其在病原微生物研究和传染病控制中的重大应用意义。目前生物芯片在病毒性疾病诊断方面已经有产品问世。包括检测逆转录酶基因的艾滋病毒（HIV）芯片、肝炎病毒（HBV、HCV 等）诊断芯片。相信随着现代分子生物学技术的迅速发展，生物芯片必将成为感染性疾病诊断的主导技术。 1DNA 芯片技术的基本要点 所有的 DNA 芯片技术都包含四个基本要点：DNA 方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。 （1）DNA 方阵的构建方法 DNA 方阵的构建一般有三种方法：光蚀刻法合成寡核苷酸或肽核酸PNA、压电印刷法、预先合成寡核苷酸或 PNA 后再通过机械接触组成方阵，如图 1 所示。其中第一、第二种方法都属于原位合成范畴。 光蚀刻法主要由美国 Affymetrix 公司采用，其基本过程为：水银光有选择性地照射到有光掩蔽剂（M1）保护的玻璃片上，以去掉玻璃片上的光敏基因X，从而激活 DNA 的合成过程。在去掉光敏基因的特定部位偶联一个光保护碱基A-X。再将第二次光掩蔽剂M2置于这个受光保护的碱基上。不断地去保护和偶联就可以得到 30 个碱基长度的寡核苷酸片段。许多这样的不同序列的片段就构成 DNA 方阵。光蚀刻法的优点在于精确性高，缺点是制造光掩蔽剂既费时又昂贵。 压电印刷法主要是美国加州 Icye Pharmaceuticals 公司和 Protogen 公司所采用，其原理类似于目前所用的喷墨打印机：打印机头在方阵上移动，在方阵每点上电流使喷头放大，并将装有某种碱基的试剂滴出 1l 到晶片表面，然后固定。在洗脱和去保护后，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。这种合成方式的各步收率超过常规的多孔玻璃controlled pore glassCPG合成法，一次可以合成4050 个碱基长度的寡核苷酸。大量的寡核苷酸就可构成方阵。压电印刷法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高的效率，但制造工艺还不太成熟。62 最后一种方式是采用传统的 CPG 法合成的寡核苷酸或寡 PNA，通过直接接触或用精细的微量加液管置于晶片上构成方阵。这种方式主要为美国加州的 Narogen 公司所采用。这个过程的关键在于方阵中各点都已电极化，从而能用可控电场将事先合成并经生物素标记的寡核苷酸固定到各点上。整个过程虽然看来十分繁琐，但在现代高效率机器人的帮助下，大规模利用这种技术生产 DNA 芯片已成为现实。它的优点在于芯片制造速度快、成本低，而且芯片之间制造误差小；其缺点在于：与原位合成法相比，构成方阵的 DAN 片段需事先合成、纯化，以及在制造 DNA 芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段分别保存。 方阵构建分子的选择 构成方阵的分子可视 DNA 芯片本身用途的不同而异。如果是测序、分析等位基因和检测点突变，一般采用 810 个碱基长度的 DNA 或新合成的 DNA 替代分子 PNA；如果是 mRNA 的转录情况分析，则可采用分离的克隆 cDNA 构建方阵，因为其片段较长，适于图谱分析。 （2）样品 DNA 或 mRNA 的制备 从血液或组织中获取的病毒或基因组 DNA/mRNA 样品在标记以前通常都要加以扩增以提高灵敏度，从某种病毒感染的细胞中特异性地扩增目的片断（通常为病毒基因）而避免成千上万个正常基因的干扰。美国 Mosaic Technology 公司发展了一种固相 PCR 系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和 DNA 样品及 PCR 试剂相混合时，如果样品包含靶序列，DNA 就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链 DNA 环或“桥”。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。 （3）杂交 1）杂交条件的选择 杂交是 DNA 芯片技术中除 DNA 方阵构建外最重要的一步，其复杂的程度和具体条件的控制由芯片中 DNA 片段的长短和芯片本身的用途而定。如果是表达检测，杂交时需要高盐浓度、低温和较长的时间往往要求过夜，但严谨性要求则比较低。如果要检测病毒基因组是否有突变，由于涉及单个碱基的错配，故要在短时间内几小时采用低盐、高温条件进行高严谨性杂交。 影响基因芯片杂交的因素很多，英国牛津大学 Southem 研究组发现，其中位阻因素的影响尤其重要：合适长度的 DNA 片段可有利于杂交；DNA 分子中任何带正电或负电的残基都会影响杂交效率。另外，在有利于杂交双链形成的条件下，探针分子本身也有利于形成自身双链的二级结构甚至三级结构，使靶序列不易被探测到。解决杂交中诸多问题的最好方法就是用 PNA 代替 DNA 制成芯片。 2）PNA 的结构及其优越性 PNA 是丹麦科学家 Nielsen 于 1991 年首先合成，其基本骨架由重复的 N-2-氨乙甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。由于它不象 DNA那样在核糖磷酸骨架中存在带负电的磷酸基团，因而杂交时不需盐离子以抵消 DNA 之间的静电排斥。这样 DNA 与 PNA 更易靠近而形成杂交分子，不会因静电斥力形成自身二级、三级结构，并且形成的 DNA-PNA 杂交分子的稳定性和碱基配对的特异性也大大提高。由于上述显著优点，虽然 PNA的制造比 DNA 要麻烦一些，但仍大有替代 DNA 而成为芯片制造首选材料的趋势。 （4）杂交图谱的检测和读出 目前 DNA 探针大多采用荧光标记法，并根据各杂交点的荧光信号强弱用扫描同焦显微镜读出。它的优点是重复性好，缺点是灵敏度相对较低。为此，人们正在研究多种替代方法，如:质谱法、化 63学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等。其中最有前途的当推质谱法，因为它可以在各 DNA 方阵点上提供更多、更快、更精确的信息以供读出。用质谱法不仅可以准确地判断是否存在基因突变，还可精确地判断它位于序列的哪一位置上。但由于探针的化学合成还存在一些问题，所以目前质谱法还不如荧光标记用得普遍。 由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现图谱上，形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都由安装了专门软件的计算机来完成，而不是由人工通过对比进行阅读。 （5）DNA 芯片技术的应用 测序 这是 DNA 芯片技术最早的用途，为美国的几个科研小组于 80 年代末各自独立提出和研究出来的。具体做法如下：把八聚体核苷酸的全组合，即所有可能的 65536 种组合的八聚合体，按只差一个碱基的顺序固定到一小片载体上。将未知序列的 DNA 探针与之杂交，得到特定的杂交图谱，进而分析出 DNA 顺序。 1）转录情况分析 将不同条件下从某生物体中转录出来的所有 mRNA 经标记成为探针后，再与代表它所有基因而制成的寡核苷酸/PNA 方阵杂交。通过分析杂交位点及其信号强弱，就可得出不同情况下病毒或细胞中每个基因是否表达及表达多少。在病毒的检测及研究中，常常需要了解病毒基因的表达状况及对细胞表达谱的影响。 由于转录情况分析直接涉及到功能基因表达基因，它已成为 DNA 芯片研究中的一个重点和热点。众所周知，在人类基因组中只有大约 3的序列能有表达，直接通过测序等手段来了解功能基因的情况相当费时、费力。改用功能基因转录出来的 mRNA 与微方阵杂交以研究功能基因，其效率可提高 30 倍以上。据估计，一个由 100000 个不同 cDNA 构成的微方阵可通过一次杂交对整个人类基因组的表达情况进行检测。 2）基因诊断与基因药物的设计 从正常人的基因组中分离 DNA 并与 DNA 芯片上方阵杂交，可得到标准图谱。从病人基因组中分离 DNA 并与方阵杂交就得到病变图谱。通过这两种图谱的比较、分析，就可以得出病变的 DNA 信息：病毒是否存在、病毒基因是否表达、细胞受病毒感染后表达谱发生了哪些变化等等。得出正确的诊断后，就可针对病毒序列或病变的靶序列设计基因药物，以改变靶序列的表达情况从而达到治疗的目的。 3）感染性疾病病原的检测 目前 DNA 芯片在病毒性疾病诊断方面已经有产品问世。包括检测逆转录酶基因的艾滋病毒（HIV）芯片、肝炎病毒（HBV、HCV 等）诊断芯片。理论上，一片高密度芯片可以覆盖绝大多数人类病毒基因。但真正实现这一目标，尚需解决许多具体的技术问题。 基因芯片在人类病毒性疾病的诊断和研究中的意义非常巨大。但由于目前基因芯片技术尚不够完善，还在不断发展之中，特别是其价格昂贵，对操作的要求较高，使其应用范围受到很大的限制。相信在不远的将来，随着现代分子生物学技术的迅速发展，基因芯片必将在病毒性疾病研究领域中发挥越来越大的作用。64 二、基因诊断在传染病临床和研究中的应用 （一）传染病监测 传染病监测是预防和控制传染病