2016年基因导入真核细胞的方法(陈加祥).ppt

基因导入细胞的方法 转化和转染 陈加祥PhD chenjiaxiang 一 大肠杆菌的转化 一 大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备 二 感受态细菌的制备步骤 三 大肠杆菌的转化 四 菌落的观察二 细胞转染 一 物理介导 二 化学介导 三 生物介导三 细胞转染分类四 影响转染效率的因素五 转染效率的检测 一 大肠杆菌的转化 转化 Transformation 是将外源DNA分子引入受体细胞 使之获得新的遗传性状的一种手段 它是微生物遗传 分子遗传 基因工程等研究领域的基本实验技术 在自然条件下 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 但在人工构建的质粒载体中 一般缺乏此种转移所必需的mob基因 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移 如需将质粒载体转移进受体细菌 需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株 即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 R M 它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代 受体细胞经过一些特殊方法 如电击法和CaCl2等化学试剂法 的处理后 细胞膜的通透性发生了暂时性的改变 成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 Compenentcells 进入受体细胞的DNA分子通过复制 表达实现遗传信息的转移 使受体细胞出现新的遗传性状 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养 即可筛选出转化子 Transformant 即带有异源DNA分子的受体细胞 宿主细菌 含Amp培养基 目前最常用的感受态细胞制备方法为CaCl2法 简便易行 且其转化效率完全可以满足一般实验的要求 制备出的感受态细胞暂时不用时 可加入占总体积15 10 30 的无菌甘油于 70 保存 半年 因此CaCl2法为使用更广泛 一 大肠杆菌感受态细菌的制备试剂准备 氯化钙法 1 制备感受态所需溶液的配制 液体LB培养基配制分别称取10g胰蛋白胨 5g酵母提取物 5gNaCl 溶于950mL去离子水 用NaOH调pH至7 0 加去离子水定容至1000mL 高温高压灭菌后 4 保存 氯化钙转化试剂配制0 1mol LCaCl2 MgCl2 感受态制备用 80mmol LMgCl2 20mmol LCaCl2 去离子水配置 高温高压灭菌后 4 保存 二 感受态细菌的制备步骤 1 从37 培养16 20h的新鲜平板中挑取一个DH5 单菌落 直径2 3mm 转到含有100mLLB培养基的1L烧瓶中 于37 剧烈振摇培养约3h 2 为得到有效转化 活细胞数不应超过10个 mL 可每隔20 30min测量OD600值来监测培养物的生长情况 待菌液OD600达到0 35时开始收获细菌培养物 3 在无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50mL无菌管中 在冰上放置10min 使培养物冷却至0 4 于4 4100rpm离心10min回收细胞 倒出培养液 将管倒置1min以使最后残留的培养液流尽 5 每50mL初始培养物用30mL预冷的0 1mol LCaCl2 MgCl2溶液重悬 再于4 以4100rpm离心10min 回收细胞 6 弃上清 将管倒置1min以使最后残留的液体流尽 7 每50mL初始培养物用2mL预冷的0 1mol LCaCl2 MgCl2悬浮 即制备成感受态细胞 可即刻使用 也可加甘油保护剂 30 分装后 70 保存 临用时冰上解冻 三 大肠杆菌的转化 1 从 70 冰箱中取200 l感受态细胞悬液 室温下使其解冻 解冻后立即置冰上 2 加入质粒DNA溶液 含量不超过50ng 体积不超过10 l 轻轻摇匀 冰上放置30分钟后 3 42 水浴中热击90秒 热击后迅速置于冰上冷却3 5分钟 4 向管中加入1mlLB液体培养基 不含Amp 混匀后37 振荡培养1小时 使细菌恢复正常生长状态 并表达质粒编码的抗生素抗性基因 Ampr 5 将菌液4000rpm离心5min 剩100 l液体混匀后 涂布于含Amp的筛选平板上 正面向上放置半小时 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿 37 培养16 24小时 对照的设置 阴性对照 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液 其它操作与上面相同 此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现 阳性对照 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液 但涂板时只取5 L菌液涂布于不含抗生素的LB平板上 此组正常情况下应产生大量菌落 请问 为什么要设对照 不设对照行不行 四 菌落的观察 二 细胞转染 细胞转染是将外源性基因导入真核细胞内的一种技术 随着基因与蛋白功能研究的深入 转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法 转染大致可分为物理介导 化学介导和生物介导三类途径 磷酸钙DEAE 葡聚糖脂质体 1 电穿孔法 电流能够可逆性地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔 促使DNA分子进入胞内的方法 机理 1 电穿孔的攻击引起细胞膜凹陷然后瞬时形成直径波动在2nm至数纳米之间的疏水小孔 2 某些较大的疏水孔变成亲水性的小孔 这是由于穿膜电压增加时形成水性小孔所需的能量小 维持亲水性小孔所需的能量远远小于维持疏水性小孔 一 物理介导 电穿孔操作步骤 MicroPulser电穿孔仪 影响电穿孔转染效率的因素 1 外加电场强度 电压过低不行 过高会杀死大量的细胞 通常250V cm 750V cm 2 电脉冲的长度 20 100ms 由电容量和电转化池的大小决定 3 温度 室温或0 效果好 电穿孔前后0 然后用温热的培养基稀释铺板 4 DNA的构象与浓度 线状比超螺旋效率高 浓度 1 40 g ml 5 培养基的离子成分 用HEPES的buffer比蔗糖的buffer要好 6 细胞状态 对数期生长的 活跃分裂的细胞培养物转染效果好 优点 转染效率较高 缺点 需要昂贵的仪器 电穿孔仪 对细胞的损伤较大 每次转染需要更多的细胞和DNA 每种细胞电转的条件都需要进行多次优化 2 显微注射 借助显微注射器直接把DNA注入核内 使之整合入受体细胞基因组中 优点 转染效率高 可用于瞬时转染和稳定转染 缺点 导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射 不适合大量转染 3 基因枪 基因枪技术 颗粒轰击 是一种全新的基因导入技术 它把遗传物质或其他物质附着于高速微弹直接射入细胞内的物理方法 是目前国际上较先进的基因导入技术 气体基因枪可在广泛的细胞类型中得到瞬间的稳定和高效率的表达 转化 气体基因枪有一个产生气体冲击波的特殊结构 在恰当的气压范围内将包覆DNA的粒子穿越 射入在轰击室底部的靶细胞中 基因枪通过用DNA包被的金属粒子在细胞厚壁上打个洞而将DNA进入细胞内或胞内细胞器的方法 高压气体基因枪 基因枪转染效率的影响因素 基因枪类型和设置 真空度 氦压 枪离靶细胞的距离微载体 一般是钨和金粒子 钨粒子大小不规则 有毒性 易氧化 易导致DNA降解 金粒子大小规则 毒性小 但与DNA结合效率低 价格贵 细胞类型 细菌 植物 动物 不同类型细胞条件不同 细胞生长 密度 生长对数期等 培养基 细菌和植物细胞高渗培养基较好 用甘露醇0 05 1 5mol L 基因枪适用于动植物 细胞培养物 胚胎 细菌及小型动物的转基因 具有快速 简便 安全 高效的特点 二 化学介导 1 磷酸钙共沉淀法 磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合 氯化钙 DNA 磷酸缓冲液按一定的比例混和 形成极小的磷酸钙 DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面 借助内吞作用进入细胞质 沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要 溶液的准备 2 HEPES 500ml NaCl 氯化钠 8 0gNa2HPO4 7H2O 七水磷酸氢二钠 0 198gHEPES6 5gH2Oto500mlpH7 05 用NaOH调节pH值 过滤除菌2MCaCl2 过滤除菌 转染步骤 1 接种前1d 接种细胞 在转染时细胞汇合度约为80 左右 2 取一个eppendoff管 依次加入10ug质粒DNA 0 172ml的灭菌水 0 2ml的2 HEPES缓冲液 混合均匀 3 吸取25ul的2MCaCl2溶液 缓慢的加入到eppendoff管中的混合液中 边加边轻微振动 使加入的CaCl2与混合液混合均匀 4 加入CaCl2后 静止混合液10分钟 出现轻微云雾状混浊 5 将混合液加入到培养细胞的平皿中 轻微振荡混匀 将细胞放置在37 5 CO2的培养箱中培养 6 4小时后 镜下观察细胞之间会有沙状颗粒 这是CaCl2颗粒 不用担心 18 24小时后更换培养液 优点 能用于任何DNA导入哺乳类动物 瞬时转染和稳定转染 缺点 转染效率低 进入细胞的DNA只有 可以进入细胞核 其中只有不到 的DNA可以与细胞DNA整合 在细胞中进行稳定表达 重复性不佳 pH值 钙离子浓度 DNA浓度 沉淀反应时间 细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响 2 脂质体转染法 当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时 分子的疏水尾部倾向于聚集在一起 避开水相 而亲水头部暴露在水相 形成具有双分子层结构的的封闭囊泡 称为脂质体 带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上 形成DNA 阳离子脂质体复合物 从而吸附到带负电的细胞膜表面 经过内吞被导入细胞 脂质体 liposome 是一种人工膜 在水中磷脂分子亲水头部插入水中 疏水尾部伸向空气 搅动后形成双层脂分子的球形脂质体 直径25 1000nm不等 脂质体可用于转基因 或制备的药物 利用脂质体可以和细胞膜融合的特点 将药物送入细胞内部 1 脂质体的组成 1 磷脂类 包括天然磷脂和合成磷脂二类 磷脂的结构特点为一个磷酸基和一个季铵盐基组成的亲水性基团 以及由两个较长的烃基组成的亲脂性基团 天然磷脂以卵磷脂 磷脂酰胆碱 PC 为主 来源于蛋黄和大豆 显中性 合成磷脂主要有DPPP 二棕榈酰磷脂酰胆碱 DPPE 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 DSPC 二硬脂酰磷脂酰胆碱 等 其均属氢化磷脂类 具有性质稳定 抗氧化性强 成品稳定等特点 2 胆固醇 胆固醇与磷脂是共同构成细胞膜和脂质体的基础物质 胆固醇具有调节膜流动性的作用 故可称为脂质体 流动性缓冲剂 2 脂质体转染步骤 1 转染前一天 接种细胞到直径60mm培养皿中 转染前保持细胞密度为60 80 2 在转染前1h更换新鲜的DMEM培养基 3 取10 g质粒DNA 加入注射用生理盐水 或相应的缓冲液 中 至总体积为200 L 轻轻混匀 室温放置 4 取VigoFect转染试剂4 L 加入稀释液中至总体积为100 L 轻轻混匀 室温放置5min 5 然后将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中 轻轻混匀 所得的转染工作液在室温放置15min 6 将转染工作液轻轻混匀 逐滴加入细胞的培养液中 轻轻混匀培养液 置37 5 CO2培养 7 转染后4 6h去除含转染液的培养液 更换为新鲜的完全培养液 8 继续培养24h后 观察转染效率 3 转染注意事项 细胞转染步骤不是太多 看上去相对比较简单 但如果以下事项没注意 很有可能导致转染效率非常低 1 转染前接种细胞的时间比较重要 一般24h比较合适 如果太短 细胞状态不好 如果太长 则细胞不容易内吞这些转染试剂 从而导致转染效率低 2 细胞接种的密度最好为60 80 太高或太低 转染效率都会降低 3 在转染前1h更换新鲜的培养基 有利于细胞的生长 4 最好是将转染试剂缓缓加至稀释好的DNA溶液中 而不是将稀释好的DNA溶液加至转染试剂中 顺序不能反 否则不容易形成DNA 脂质体复合体 5 质粒DNA的起始量为10ug 转染试剂的起始量为4ul 但在实际转染时转染效率不是很高 则可以先固定转染试剂的量 逐渐调整DNA的用量 或是先固定DNA的用量 再逐渐调整转染试剂的量 从而找到对你所做的细胞的最适的用量 6 一般的转染试剂毒性都比较小 如果对细胞影响较大 可在在转染后4 6h更换新鲜培养基 优点 适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞 可用于瞬时转染和稳定转染 转染效率高 比磷酸钙法高5 100倍 能够把DNA和RNA转染到各种细胞 转染的稳定性好 可重复性高 转染时最好不加血清和抗生素 缺点 阳离子脂质体细胞毒性相对较高 对部分细胞可能会干扰细胞的代谢 3 DEAE 葡聚糖介导的转染 带正电的DEAE 葡聚糖或polybrene 聚凝胺 多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面 通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入 其原理还不清楚 可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核 1 转染步骤 1 接种细胞至培养皿中 在转染的当天细胞密度约为50 2 用10mL1 PBS 4mL10 富含生长因子血清的DMEM洗培养板 3 在80 L热的10g LDEAE 葡聚糖中缓慢加入质粒DNA 混匀 取120 LDNA DEAE 葡聚糖加到细胞培养板中 使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色 培养4小时 4 从培养板中吸出DNA DEAE 葡聚糖 加入5mL10 DMSO 室温放置1分钟 吸出DMSO 用5mL1 PBS洗一次吸出 加入10mL培养液 10 血清的DMEM 5 培养细胞 在适当时间分析细胞 若含有抗药基因 可用G418选择培养液培养 方法同前 2 影响转染效率的因素 1 DEAE 葡聚糖浓度以及细胞与DNA DEAE 葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系 可采用较高浓度的DEAE 葡聚糖 1g L 作用较短时间 30分钟 1 5小时 又可用较低浓度 0 25g L 的DEAE 葡聚糖作用较长时间 8小时 前者效率高但会出现早期抑制 后者可靠效率低 可借助促进剂 2 促进剂 DMSO 甘油 增加细胞渗透性 促进内吞作用 可以提高效率50倍 3 细胞密度与生长状态 4 转染的DNA量 1 慢病毒介导的DNA转染以病毒作为载体 通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中 其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用 三 生物介导 慢病毒载体 Lentiviralvector LVs 是在HIV 1病毒基础上改造而成的病毒载体系统 它能高效将目的基因 或RNAi 导入动物和人的原代细胞或细胞系 慢病毒载体基因组是正链RNA 其基因组进入细胞后 在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA 形成DNA整合前复合体 进入细胞核后 DNA整合到细胞基因组中 整合后的DNA转录mRNA 回到细胞浆中 表达目的蛋白 或产生RNAi干扰 与HIV 1相比 慢病毒载体改造包括以下部分 1 5 LTR的U3区被RSV的enhancer promoter取代 3 LTR的U3区缺失2 HIV 1的全部9种蛋白HIV 1的全部9种蛋白 包括gag pol env等从载体基因组中缺失3 目的基因由CMV启动子控制 SV40启动子控制抗性基因BSD Blasticidin 或报告基因EGFP 慢病毒载体不表达任何HIV 1蛋白 免疫原性低 在注射部位无细胞免疫反应 体液免疫反应也较低 不影响病毒载体的第2次注射 1 感染方法 1 按实验需要将细胞铺板 细胞数以第2天密度约50 为宜 37 培养过夜 2 感染前 从冰箱取出并在37 水浴中快速融化病毒 用新鲜完全培养基稀释成所需浓度 注意 轻轻混匀 不要使用振荡器 3 吸去细胞原有培养基 将稀释好的病毒液加入细胞中 并加入聚凝胺 Polybrene 轻轻摇匀 37 培养过夜 聚凝胺是一种聚阳离子 可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用 终浓度为6mg ml 感染后第二天 吸去含病毒的培养液 换上新鲜的培养基 继续37 培养 4 感染后第三天 根据需要 或收集细胞检测目的蛋白的表达 或换上含适当浓度的Blasticidin 杀稻瘟菌素 的新鲜完全培养液 筛选稳定转导的细胞株 5 每3 4天换含Blasticidin的完全培养液一次 6 换上Blasticidin后10 12天 抗Blasticidin的细胞克隆将形成 挑选至少5个克隆 进行细胞扩增后 检测目的蛋白的表达 慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定 原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中 并随细胞基因组的分裂而分裂 另外 慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中 以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比 比如不整合的腺病毒载体 整合率低的腺相关病毒载体 只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体 有鲜明的特色 2 慢病毒载体应用 1 将目的基因 RNAi基因转入难以转染的细胞 比如神经元细胞 干细胞或其它原代细胞2 将目的基因 RNAi基因转入动物组织 以期获得长期表达 构建稳定表达目的蛋白 RNAi的细胞系 再用exvivo的方法导入动物体内 基因治疗转基因动物基因敲减3 药物研究 构建表达受体蛋白的细胞系 研究药物的作用 快速建立生产目的蛋白的细胞系 是非常有前途的真核细胞表达方法 优点 整合效率高 可使外源基因在宿主细胞中长期表达 适用于难以转染的原代细胞 缺点 存在潜在的安全危险性 2 农杆菌介导的DNA转染 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌 1970年人们发现它是植物致瘤的起因 它在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位 植物细胞被侵染后形成肿瘤 能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌 诱发毛状根的称为发根农杆菌 其中根癌农杆菌在转基因技术中的应用相对较多 根癌农杆菌的Ti质粒上有一段转移DNA T DNA 具有向植物细胞传递外源基因的能力 而细菌本身并不进入受体细胞 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应 主要包括 受伤的植物细胞为修复创伤部位 释放一些糖类 酚类等信号分子 在信号分子的诱导下 农杆菌向受伤组织集中 并吸附在细胞表面 转移DNA上的毒粒基因被激活并表达 同时形成转移DNA的中间体 转移DNA进入植物细胞 并整合到植物细胞基因组中 因为单子叶植物不是农杆菌的天然寄主 况且其不能合成起诱导作用的信号分子 所以限制了农杆菌介导法在单子叶植物中的应用 不过近年来大量成功转化的实例表明 植物 真菌 哺乳动物甚至人类细胞都可以作为农杆菌的受体 农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体 通过真空渗透法 浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触 以完成可遗传细胞的转化 然后利用组织培养的方法培育出转基因植株 并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代 特点 费用低 拷贝数低 重复性好 基因沉默现象少 转育周期短及能转化较大片段等 三 细胞转染分类 1 瞬时转染 是指外源基因进入受体细胞后 存在于游离的载体上 不整合到细胞的染色体上 2 稳定转染 DNA整合到宿主细胞的染色体中 1 瞬时转染 外源DNA RNA不整合到宿主染色体中 因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数 产生高水平的表达 但通常只持续几天 多用于启动子和其它调控元件的分析 一般来说 超螺旋质粒DNA转染效率较高 在转染后24 72小时内分析结果 常常用到一些报告系统如荧光蛋白 半乳糖苷酶等来帮助检测 2 稳定转染 外源DNA既可以整合到宿主染色体中 也可能作为一种游离体 episome 存在 尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高 外源DNA整合到染色体中概率很小 大约1 104 转染细胞能整合 通常需要通过一些选择性标记 如氨基糖苷磷酸转移酶 APH 新霉素抗性基因 潮霉素B磷酸转移酶 HPH 胸苷激酶 TK 等反复筛选 得到稳定转染的同源细胞系 四 影响转染效率的因素 1 细胞培养物 健康的细胞培养物是成功转染的基础 不同细胞有不同的培养基 血清和添加物 低的细胞代数 50 能确保基因型不变 高的转染效率需要一定的细胞密度 一般的转染试剂都会有专门的说明 一般在转染前24小时接种细胞 这将提供正常细胞代谢 增加对外源DNA摄入的可能 一定要避免细菌 支原体或真菌的污染 2 血清 大多数培养基在使用前需要加血清 血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物 对不同细胞的生长作用有很大的差别 血清质量的变化直接影响转染效率 因此在转染前建议先测试出对细胞生长良好的血清批号 转染时用同一批号的血清 并同时测试对细胞生长是否有影响 不加转染试剂及外源DNA 有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低 因此有些转染试剂要求在转染前要去除血清 3 载体的类型及形态 不同的载体 病毒载体 质粒DNA RNA PCR产物