分光光度计的操作与使用.ppt

设计教师 乌兰察布职业学院马铃薯系段伟伟 农产品质量检测仪器分析课程 紫外 可见分光光度计的操作与使用 乌兰察布职业学院马铃薯工程系 可见分光光度法 可见分光光度法是利用测量有色物质对某一单色光的吸收程度来进行测定的 可见分光光度计主要部件 1 光源 2 单色器 包括狭缝 准直镜 色散元件 3 吸收池 玻璃 能吸收UV光 仅适用于可见光区石英 不能吸收紫外光 适用于紫外和可见光区要求 匹配性 对光的吸收和反射应一致 4 检测器 将光信号转变为电信号的装置 5 记录装置 讯号处理和显示系统 可见分光光度法 一 显色反应及显色条件的选择1 显色反应将试样中被测组分转化成有色化合物的反应 2 显色剂在显色反应中与被测组分生成有色化合物的试剂 无机显色剂 硫氰酸盐 钼酸铵 过氧化氢 氨水等 有机显色剂 如磺基水杨酸 邻菲罗啉 结晶紫 孔雀绿等 3 选择显色反应时应考虑的因素 1 灵敏度高2 选择性高3 生成物稳定4 显色剂在测定波长处无明显吸收 与有色物最大吸收波长之差 对比度 应满足 60nm 4 显色条件的选择 1 显色剂用量 固定待测组分的浓度和其他条件只改变显色剂浓度测定吸光度 做A 显色剂剂用量cR的关系曲线如图 选择曲线变化平坦处作为显色条件 2 溶液的pH值固定待测组分的浓度和其他条件只改变溶液的pH值测定吸光度 做A pH曲线 选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围 3 显色温度固定待测组分的浓度和其他条件只改变反应温度 测定吸光度 做A T曲线 选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的温度范围 4 显色时间及稳定时间固定待测组分的浓度和其他条件只改变反应的时间 测定吸光度 做A t曲线 选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的时间范围 图12 9吸光度与pH关系曲线 5 干扰的消除1 加入掩蔽剂选择掩蔽剂的原则是 掩蔽剂不与待测组分反应 掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定 例 测定Ti4 加入H3PO4掩蔽剂使Fe3 黄色 成为 Fe PO 2 3 无色 消除Fe3 的干扰 2 分离干扰离子采用适当的分离方法预先除去干扰物质 3 选择适当的显色反应条件通过控制适宜的显色条件 消除干扰组分的影响 4 选择适宜的波长避开干扰物的最大吸收 配制适当的参比液 消除干扰组分的影响 5 提高显色反应的选择性利用被测物能形成三元络合物的特点 提高显色反应的选择性 三 吸光度测定条件的选择1 选择适当的入射波长一般应该选择 max为入射光波长 但如果 max处有共存组分干扰时 则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长 吸光度测定条件的选择曲线A为钴络合物的吸收曲线曲线B为显色剂的吸收曲线 2 选择适当的参比溶液 注 采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收 光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰 参比溶液的选择一般遵循以下原则 3 控制适宜的吸光度读数范围 选A 0 2 0 8 1 当光从一种介质传播到另一种介质中时 下列 保持不变 A 波长 C 速度 B 频率 D 方向 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 2 光的粒子性表现在下述 性质上 B 频率 A 能量 C 波长 D 波数 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 3 下列 光谱属于分子吸收光谱 B 分子磷光光谱 A 分子荧光光谱 D 紫外 可见光谱 C 分子化学光谱 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 4 紫外 可见光谱的产生是由于分子在吸收紫外 可见光后 发生 类型的跃迁 A 振动能级跃迁 B 转动能级跃迁 C 电子能级跃迁 D 以上答案都不是 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 1 朗伯 比耳定律的物理意义是什么 写出其数学表达式 2 什么是吸收曲线 什么是标准曲线 它们有何实际意义 3 显色反应如何选择 4 吸光度测量条件如何选择 5 光度分析法中 参比溶液应如何选择 答案 问答题 1 答 当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时 溶液的吸光度A与液层的厚度b和溶液的浓度c成正比 即A lg I0 I bc 3 答 以入射光波长作横坐标 用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线 称为吸收曲线 其作用是 选择入射光波长 在此波长下测量吸光度 则分析的灵敏度最高 因此 吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的重要依据 在某特定波长下 用分光光度计测量一系列不同浓度的标准溶液的吸光度 然后以浓度为横坐标 对应的吸光度值为纵坐标所绘制的曲线 称为标准曲线 亦称工作曲线 它是作为待测物质定量分析的依据 如果在相同条件下测得待测试液的吸光度值 从标准曲线上就可查得待测试液的浓度 这就是标准曲线法 4 答 显色反应的选择原则是 1 选择生成的有色物质 MR 的 较大的显色反应 2 显色剂 R 在测定波长处无吸收 即 尽可能小 3 反应生成的有色物质 MR 的组成要恒定 化学性质稳定 5 答 吸光度测量条件包括三个主要方面 1 入射光波长的选择 入射光的波长应根据吸收曲线选择 max为宜 因在此波长处 值最大 使测定具有较高的灵敏度 2 参比溶液的选择 在吸光度的测量中 由于比色皿的反射以及溶剂 试剂等对光的吸收 使得 测得的吸光度值不能真实地反映待测物质对光的吸收 也就不能真实地反映待测物质的浓度 为了校正上述影响需要正确选择参比溶液 通过调节仪器使参比溶液的吸光度为零 A 0 或透光度T 100 借此消除上述影响 3 吸光度读数范围的选择吸光度值太大或太小时 读数波动所引起的吸光度读数误差较大 为了减小读数误差 应使测量的吸光度值控制在A 0 15 1 0 或透光度T在75 10 范围之内 可以采用以下措施 a 控制溶液的浓度 如改变试样的称量 或改变溶液的稀释度等 b 选择不同厚度的比色皿 以改变光程的长度 6 答 参比溶液的选择原则如下 1 若仅待测物 M 与显色剂 R 的反应产物 MR 有吸收 可用蒸馏水作参比溶液 2 若待测物 M 无吸收 而显色剂 R 或其它试剂 R 有吸收 则用不加试样的空白溶液作参比溶液 3 若试样中的其它组分有吸收 待测物M之外的组分 如N 但不与显色剂反应 当显色剂无吸收时 可用试样溶液作参比溶液 当显色剂有吸收时 可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂 以此溶液作参比溶液 总之 选择参比溶液的原则是 应使测得的试液的吸光度能真正反映待测物的浓度 紫外 可见分光光度法的应用 定性分析 定量分析 应用 光谱对照 特征数据比较 吸光度比值的比较 单一组分的测定 多组分的测定 吸光系数 吸光系数k的物理意义为 液层厚度为1cm的单位浓度溶液的吸光度 它表示物质对特定波长光的吸收能力 一个物质在一定条件下的吸光系数为定值 通常有两种表示方法 物理意义是指样品浓度为1mol L 1的溶液置于1cm样品池中 在一定波长下测得的吸光度值 量纲为L mol 1 cm 1 一 摩尔吸光系数 二 吸光系数a 物理意义是指溶液浓度在1g L 液层厚度为1cm时 在一定波长下的吸光度值 量纲为L g 1 cm 1 吸光系数和摩尔吸光系数有如下关系 a M M为摩尔质量 例4 1用氯霉素 分子量为323 15 纯品配制100mL含2 00mg的溶液 使用1 00cm的吸收池 在波长为278nm处测得其透射率为24 3 试计算氯霉素在278nm波长处的摩尔吸光系数和比吸光系数 解 已知 278nmM 323 15g molc 2 00 10 2T 24 3 三 吸光系数 四 吸收光谱 不同浓度KMnO4溶液的吸收光谱 五 吸收光谱 一 定性分析 1 光谱对照同样条件下测定待测物和标准物的吸收光谱 如果两者吸收光谱一样 可认为是同一物质 如无标准物 也可比较标准谱图集里的光谱 2 特征数据比较最大吸收波长 max和吸光系数 是用于定性鉴别的主要光谱数据 3 吸光度比值的比较有些物质的光谱上有几个吸收峰 可在不同的吸收峰 谷 处测得吸光度的比值作为鉴别的依据 一 定性分析 二 定量分析 定量分析的依据是1 单一组分的测定 1 吸光系数法查得吸光系数后根据吸光度求得样品浓度 例4 5已知维生素B12在361nm处的吸光系数为20 7 精密称取样品30 0mg 加水溶解后稀释至1000mL 在该波长处用1 00cm吸收池测定溶液的吸光度为0 618 计算样品溶液中维生素B12的质量分数 解 已知A 0 618a 20 7l 1 00cm由A alc样品中维生素B12含量为 二 定量分析 1 单一组分的测定 2 标准比对法相同条件下 分别配制待测溶液X和标准溶液S 并分别测定吸光度 根据郎伯 比尔定律 可写出 二 定量分析 例4 6为测定维生素B12原料药含量 准确称取试样25 0mg 用蒸馏水溶解后 定量转移至1000ml容量瓶中 加蒸馏水至刻度后 摇匀 另称取同样重量的B12标准品 用蒸馏水溶解后 稀释至1000ml 摇匀 在361nm波长处 用1cm比色皿分别测得样品溶液和标准品溶液的吸光度分别为0 512和0 518 求试样中B12的百分含量 解 已知Ax 0 512As 0 518两溶液配制 稀释方法一致 二 定量分析 1 单一组分的测定 3 标准曲线法用标准曲线法测铁的浓度为例 配一系列浓度的标准铁溶液 依次测定吸光度 作c A图 即标准曲线 三磺基水杨酸合铁配合物波长420nm 将待测溶液吸光度AX代入标准曲线 读出浓度 二 定量分析 2 多组分的测定当溶液内有两个及以上组分并需测得各自含量时 就是多组分的测定 二 定量分析 2 多组分的测定 1 吸收光谱互不重叠此种情况下可以按单组分测定的方法分别求得各个组分浓度 二 定量分析 2 多组分的测定 2 吸收光谱部分重叠例如右图 可先在无干扰处 2求得a的浓度 再求得b的浓度依次求得a和b的浓度 2处 1处 二 定量分析 2 多组分的测定 3 吸收光谱相互重叠解方程组法 如右图 1处 2处 解方程组可得 二 定量分析 2 多组分的测定 3 吸收光谱相互重叠等吸收双波长消去法例如右图 选取两个波长 a物质在这两波长处的吸光度相同 1处 2处 二 定量分析 2 多组分的测定 两式相减 得 在这两个波长处两组分总的吸光度的差值 A 只和其中一个组分的浓度有关 可以依次求出各组分浓度 二 定量分析 1 指出下列哪种是紫外 可见分光光度计常用的光源 B 激光器 A 硅碳棒 D 卤钨灯 C 空心阴极灯 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 2 在一定波长处 用2 0cm吸收池测得某样品溶液的百分比透光率为71 若改用3 0cm吸收池时 该溶液的吸光度A为 A LgT 0 15 A 0 10 B 0 37 C 0 22 D 0 45 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 3 常见紫外 可见发光光度计的波长范围为 A 200 400nm B 400 750nm C 200 750nm D 400 1000nm 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 4 测定一系列浓度相近的样品溶液时 常选择的测定方法为 B 标准对比法 A 标准曲线法 C 绝对法 D 解方程计算 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 5 在分光光度法中 运用朗伯 比尔定律进行定量分析采用的入射光为 A 白光 C 可见光 B 单色光 D 紫外光 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 6 许多化合物的吸收曲线表明 它们的最大吸收常常位于200 400nm之间 对这一光谱区应选用的光源为 B 能斯特灯 A 氘灯或氢灯 C 钨灯 D 空心阴极灯灯 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 7 双波长分光光度计和单波长分光光度计的主要区别是 B 单色器的个数 A 光源的个数 D 单色器和吸收池的个数 C 吸收池的个数 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 8 符合朗伯 比尔定律的有色溶液稀释时 其最大吸收峰的波长位置 A 向长波方向移动 B 向短波方向移动 C 不移动 但最大吸收峰强度降低 D 不移动 但最大吸收峰强度增大 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 9 在符合朗伯特 比尔定律的范围内 溶液的浓度 最大吸收波长 吸光度三者的关系是 A 增加 增加 增加 C 减小 增加 减小 B 减小 不变 减小 D 增加 不变 减小 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 10 在紫外可见分光光度法测定中 使用参比溶液的作用是 B 吸收入射光中测定所需要的光波 A 调节仪器透光率的零点 D 消除试剂等非测定物质对入射光吸收的影响 C 调节入射光的光强度 很遗憾 您答错了 答对了 点此进入下一题 很遗憾 您答错了 很遗憾 您答错了 课堂练习 11 在比色法中 显色反应的显色剂选择原则错误的是 A 炽热固体发射的结果 C 显色剂的 值愈小愈好 B 显色剂的 值愈大愈好 D 显色反应产物和显色剂 在