抗菌肽替代抗生素实验实施方案.docx

抗菌肽替代抗生素对肉鸡生产性能、免疫功能及肠道健康的作用效果试验方案一、研究背景由于饲用抗生素的危害日趋严重，目前允许使用的种类越来越少，欧盟已于去年全面禁止在饲料中添加使用，所以开展抗生素替代物的研究显得非常重要。本试验以抗菌肽为研究材料，添加到肉鸡日粮中，研究不同的添加量对肉鸡的生长、消化和免疫系统的影响，并通过肠绒毛结构的观察及免疫指标的检测，探索抗菌肽增强肉鸡生产功能的机理，旨在确定应用抗菌肽替代饲用抗生素的可行性，为抗菌肽制剂在肉鸡生产中推广利用提供试验数据。二、试验设计本试验采用单因子完全随机化试验设计，将900（或720）只AA肉鸡随机分成6个处理，每个处理6个重复，每个重复25（20）只鸡，试验期为6周。试验材料：富力泰C（海纳川药业的抗菌肽）、抗菌肽D对照组（国内某企业生产的抗菌肽）、恩拉鼎F-40（先灵葆雅的恩拉霉素）。具体试验设计见表1。表1 试验设计组别处理A空白对照组（日粮不添加任何抗生素）B富力泰C1组（空白对照组日粮+50mg/kg抗菌肽）C富力泰C2组（空白对照组日粮+100mg/kg抗菌肽） D富力泰C3组（空白对照组日粮+150mg/kg抗菌肽）E抗生素对照组（日粮+200mg/kg恩拉鼎F-40组, 4ppm,不休药）F抗菌肽D对照组（日粮+200mg/kg肽生素）三、 测定指标1. 生产性能在试验的第21d和42d，每个重复的鸡空腹称重，记录前后两期（1-21d，22-42d）每个重复鸡的体重和采食量，统计计算平均日采食量、平均日增重和料重比。平均日采食量（ADFI）=总耗料量/饲养日平均日增重（ADG）=（试验末体重-起始体重）/试验天数料重比（F/G）=总耗料/总增重试验鸡每周统计一次耗料。2. 免疫功能1） 免疫器官指数测定试验第21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，称重后宰杀，解剖剥离或摘取胸腺、脾脏、法氏囊，称取各免疫器官重量。免疫器官指数计算公式：脾脏指数=脾脏重量（g）/鸡体重（kg）胸腺指数=胸腺重量（g）/鸡体重（kg）法氏囊指数=法氏囊重量（g）/鸡体重（kg） 2）血清生化指标试验第21d和42d，从每个重复中随机取2只鸡，翅静脉采血，离心分离血清，用免疫透射比浊法试剂盒，测定血清中血清白蛋白、IgG、IgM以及补体C3、C4含量。同时用免疫比浊法试剂盒测定血清中的溶菌酶。3. 肠道健康的影响1） 肠道食糜消化酶活性样品采集和处理：21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，宰杀，取小肠食糜。食糜用4的0.4mol/L氯化钠溶液稀释10倍，匀浆。将匀浆液4下1200rpm离心5min，将上清液置于20保存备测。测定淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等活性，采用南京建成生物有限公司试剂盒。2） 肠道内容物菌群测定试验第21d和42d，从每个重复中随机取2只鸡，宰杀，无菌取回盲交接处回肠、盲肠段，两端结扎，无菌操作台内称取0.5g左右肠段内容物于灭菌稀释瓶内，加入先配好已灭菌的生理盐水410倍稀释，将回盲肠内容物稀释液10ul分别接种于麦康凯培养基、MRS培养基，培养肠道内大肠杆菌、乳酸杆菌。细菌数量统计：根据菌落可数性原则，选择合适稀释度，用血球计数板统计菌落个数，换算出每克肠道内容物中所含有的细菌数，并以其对数值表示（lgN/g）。3） 小肠绒毛长度及隐窝深度比值试验第21d和42d，从个每个重复中随机取2只鸡，宰杀，取空肠（卵黄囊遗迹之上5cm）肠管约2cm，用10%甲醛磷酸缓冲液固定，做石蜡切片，HE染色，显微镜观察。4. 残留检测42d杀鸡，取肌肉及肝脏样，检测肌肉样及肝脏恩拉霉素残留，将每个重复中随机取的2只鸡的样品合并检测，加上空白对照共：3组*6重复*2肌肉及肝脏样=36个样。对于抗菌肽组，检测高、中、低及空白对照组的肌肉、肝脏、粪便中的抗菌肽基因。共4组*6重复*3=72个样。具体的引物设计请参考“转柞蚕抗菌肽CAD基因毕赤酵母GS115.CAD-1在广东省环境释放”。5. 经济效益分析4%的恩拉鼎F-40价格为120元/千克，富力泰C成本约120元/千克，肽生素成本约80元/千克。根据生长性能指标评估成本。体外试验1、产品评价检测富力泰、肽生素的药物残留（即产品是否掺有抗生素）这部分费用没有计算在总经费里。2、体外抑菌试验采用琼脂打孔法对恩拉鼎F-40、富力泰C、肽生素进行体外抑菌试验。以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及产气荚膜梭菌为病原指示菌，测以上三种产品的MIC值。以富力泰C对大肠杆菌的MIC检定为例，方法如下：1.试剂：液体LB培养基配制胰蛋白胨：1% OXOID牌 TRYPTONE酵母浸粉：0.5% OXOID牌 YEASTEXTRACTNaCl:1%技术琼脂粉（进口）：1.21.5% 广东环凯微生物科技有限公司将上述培养基配比，以水为溶剂，调pH值7.0，灭菌备用。2.大肠杆菌（ATCC25922）培养液制备：2.1 菌液制备：将大肠杆菌（ATCC25922）先接种在营养平板上，3537培养1624h。将培养后营养平板上的单菌落（56个）接种至50ml的无菌LB液体培养基中，置于摇床（转速220rpm）培养，培养温度：30度，培养时间：1012h。置4冰箱中贮存备用（菌液贮存时间不得超过3天）2.2测试菌的配制：将上述测试菌培养液放置于常温后，置分光光度计于600nm处测吸光值至2.3，如高于此吸光值，可用培养液调整测试菌液吸光值至2.3。3.检测培养基制备：3.1将灭菌后的LB培养基置室温使其冷却至48-50C，按100ml无菌LB培养基中加入100ul菌液（OD=2.3），摇匀。吸取含测试菌的LB培养基10.5ml，置90mm碟底内均匀摊布，使其在水平台面上凝固，凝固后放置20分钟后盖好陶瓦盖，备用。4.样品制备：4.2精密称定待测的试样1.0000 g，精密加入灭菌水10mL，40超声水浴15分钟使溶解。放至室温，吸取适量上述溶液于具塞灭菌离心管中，10000 rpm离心5分钟，取上清液，过0.4微米除菌膜，作供试样品溶液。4.3在上述3.1项制备好的检测培养基上用灭