[硕士学位论文]细菌产胆固醇氧化酶与红色素的相关性研究.pdf

江南大学 硕士学位论文 细菌产胆固醇氧化酶与红色素的相关性研究 姓名 霍惠芝 申请学位级别 硕士 专业 生物化学与分子生物学 指导教师 王武 杨海麟 20080601 摘要 摘要 本文以产胆固醇氧化酶 E C l 1 3 6 红色短杆菌D G C C N R 为研究对象 以提高胆固 醇氧化酶 C O D 生成水平为目的 研究了这株红色菌株产C O D 和产色素的关系 试 图利用这种相关性 创立一种理性 简易 可行的C O D 高产株筛子 遗传稳定性实验观察表明 红色菌株D G C C N R 转接8 代之后 仍然保持高产C O D 和产红色素的性质 未观察到自发的回复突变 说明其产酶和产红色素具有遗传稳定性 经生理生化测试和1 6 Sr D N A 测序鉴定 我们暂定此菌株名为红色短杆菌 研究了红色菌株D G C C N R 产C O D 与红色素 以及红色素与发酵液中底物胆固醇 胆固醇代谢产物胆甾4 烯 3 酮的关系 发现菌株D G C C N R 产C O D 与产色素成正偶联 关系 以超声波联合亚硝基胍的复合诱变方法 对红色菌株D G C C N R 进行了诱变处理 得到两株突变株D G C C N W 和D G C C N P D G C C N W 为白色菌落 D G C C N P 为淡粉 色菌落 这两株变异株在菌落颜色变淡的同时 产酶能力也相应下降 说明出发菌株 D G C C N R 本身产C O D 和产红色素存在着偶联关系 通过对培养基中主要碳 氮源 培养温度 通气量 以及培养基中添加金属离子的 优化 分析了产酶和色素色价的关系 结果表明这些因素对菌株产酶和产色素的影响基 本一致 从发酵水平说明菌株D G C C N R 产酶和产色素成正偶联关系 对菌种所产色素进行了分离提取 分析了色素与产酶在代谢上的关系 H P L C I I V M S 等仪器分析结果以及抑制剂实验表明 菌种产生的红色素为一类类胡罗卜素 关键词 胆固醇氧化酶 C O D 红色素 复合诱变 偶联效应 类胡罗卜素 A b s t r a c t A b s t r a c t W i t ht h ea i mo ft h ee x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o no ft h eC h o l e s t e r o lo x i d a s e E C l 1 3 6 C O D t h er e s e a r c hm a i n l yf o c u S e do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eC O De n z y m ea c t i v i t ya n d t h er e dp i g m e n t p r o d u c e df r o mar e db a c t e r i aD G C C N R T h ec o u p l i n ge 位c tc a nb eu s e df o r e s t a b l i s h i n gas c r e e nm e t h o dt os e l e c th i g hp r o d u c e rf r o mm u t a g e n e s i s T h eg e n e t i cs t a b i l i t ye x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h er e ds t r a i nD G C C N Rw a ss t i l l m a i n t a i n i n gi t sh i g h y i e l da c t i v i t ya n dr e dc o l o ra f t e r8r u no fp r o p a g a t i o n I tw a sc l e a rt h er e d s t r a i ns h o w e dg e n e t i cs t a b i l i z a t i o ni ni t sc o l o ra n de n z y m e y i e l da c t i v i t y a n ds p o n t a n e o u s r e v e r s em u t a t i o nh a db en of o u n d T 1 1 er e ds t r a i nW a si n i t i a li d e n t i f i e db yp h y s i o l o g i c a ia n d b i o c h e m i c a lm e t h o da n d16 Sr D N A s e q u e n c i n g a n dn a m e dr e d B r e v i b a c t e r i u m S t u d i e do nt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ne n z y m ep r o d u c t i o na n dt h er e dp i g m e n t b e t w e e n t h er e dp i g m e n ta n dc h o l e s t e r o lr e s i d u a li nf e r m e n t a t i o nl i q u i d b e t w e e nt h er e dp i g m e n ta n d c h o l e s t e r o l 4 e n 3f r o mc a t a l y s i so fc h o l e s t e r o l Ap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nC O Da c t i v i t y a n dt h er e dp i g m e n tp r o d u c i n gb yD G C C N RW a sf o u n d n l er e ds t r a i nD G C C N RW a s t r e a t e dw i t hN T G 1m g m L u n d e ru l t r a s o n i c z t i o n 2 0 0 W 5 0 K H z t w om u t a n t sw e r eo b t a i n e d O n es h o w e dw h i t ec o l o rn a m e dD G C C N W t h eo t h e ro n es h o w e dp i n kc o l o rn a m e d D G C C N P T h ee n z y m ea c t i v i t yo ft w om u t a n t sw a so b v i o u sd e c r e a s e n l ep o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nC O D a c t i v i t ya n dt h er e dp i g m e n tW a sp r o v e di nt h eo t h e ra n g l e A n a l y z e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nC O Da c t i v i t ya n dt h er e dp i g m e mp r o d u c i n gb y D G C C N Rt h r o u g hs t u d y i n go nt h ec a r b o n n i t r o g e n m e t a li o n si nt h ef e r m e n t a t i o n m e d i u m a n dc o n d i t i o n sf o rc u l t u r es u c ha st e m p e r a t u r ea n dv e n t i l a t i o n n l er e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h e r ew e r et h es o m ei m p a c to ne n z y m e y i e l da n dr e d p i g m e n t p r o d u c i n gb yt h e s ef a c t o r s a n dp r o v e dt h e p o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nC O Da c t i v i t ya n dt h er e dp i g m e n tf r o m f e r m e n t a t i o n I s o l a t e dt h er e dp i g m e n ta n da n a l y z e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nC O Da c t i v i t ya n dt h e p i g m e n tf r o mm e t a b o l i t e s A n a l y z e dh er e dp i g m e n tb y 唧L C 吣M Sm e a n sa n di n h i b i t o r e x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h ep i g m e n ti Sat y p eo f c a r o t e n o i d K e y w o r d s C h o l e s t e r o lo x i d a s e r e dp i g m e n t d u a l m u t a t i o n c o u p l i n ge f f e c t c a r o t e n o i d 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注争致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名 盈丝日瓤逊 丛主 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留 使用学位论文的规定 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件乖磁盘 允 许论文被查阅和借阅 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名 盈塾竺 导师签名 第一章绪论 第一章绪论 胆固醇是一种动物性甾醇 是构成动物细胞膜的必需组分 在人体中胆固醇主要存在 于血浆 肝 肾上腺以及细胞合成的脂质混合物中 它对人体有一系列生理生化功能 可调节消化道对脂肪的吸收 并且是胆汁酸 类固醇激素和维生素D 生物合成的前提物 质 就食品而言 胆固醇普遍存在于动物性食品中 但近年来医学研究表明 食品中高 含量的胆固醇对人体健康有不良影响 l J 研究表明人体血液中的胆固醇含量过高会引起 心 脑 血等疾病如动脉粥样硬化 冠心病 胆结石等 而胆固醇的氧化产物之一胆甾 4 一烯 3 酮能作为治疗心血管疾病和抗肥胖等的药剂1 2 J 因此开发一种专一性氧化胆固醇 为胆甾 4 烯 3 酮的胆固醇氧化酶 C O D 具有重要的意义 胆固醇氧化酶 C O D E C1 1 3 6 是胆固醇代谢途径第一步反应的关键酶 能专 一性的催化胆固醇转化为胆甾 4 烯 3 酮 胆甾烯酮 和H 2 0 2 3 4 J 目前国际上通用的生 物测定胆固醇的R i c h m o n d 法 便是根据上面的反应通过比色法定量测定反应液中 H 2 0 2 的含量 从而测定出胆固醇氧化酶酶活力 该法具有简单 高效的特征 这使的 胆固醇氧化酶在临床检测血清胆固醇含量方面具有了重要意义 6 j 如今胆固醇氧化酶己 成为一种广泛应用的临床检测用酶 7 j 1 1 胆固醇氧化酶的来源与应用前景 1 1 1 胆固醇氧化酶的来源与分布 动植物来源的胆固醇氧化酶研究较少 而微生物是胆固醇氧化酶最主要的来源 目 前的研究主要集中在微生物来源上 1 9 4 8 年T u r f i t t 首次分离鉴定了一株能分解胆固醇 的红平诺卡氏菌 N o c a r d i ae r y t h r o p o l i s 8 1 9 5 4 年S t a d t m a n 的研究阐明了胆固醇分枝 杆菌 M y c o b a c t e r i u mc h o l e s t e r o l i c u m 氧化分解胆固醇的产物是胆甾 4 烯一3 酮和H 2 0 2 确定了胆固醇氧化酶在其中的作用 并对胆固醇氧化酶的性质做了初步研究桫 1 9 7 3 年 U w a j i m a 1 0 J 首次获得了胆固醇短杆菌 B r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u mA T C C 2 1 3 8 7 的胆固醇 氧化酶的结晶 通过光谱分析检测到胆固醇氧化酶具有黄素蛋白的特征吸收峰 首次发 现了胆固醇氧化酶是核黄素腺嘌呤二核苷酸 F A D 依赖型辅酶 随着生化技术的发展 通过分析反应产物 在更多种的微生物中分离纯化和鉴定了胆固醇氧化酶 这些微生物 都能够利用胆固醇作为唯一碳源 主要包括诺卡氏菌属 N o c a r d i a 链霉菌属 S t r e p t o m y c e s 短杆菌属 B r e v i b a c t e r i u m 假单胞茵属 P s e u d o m o n a s 裂殖菌属 S c h i z o p h y l l u m 链轮丝菌属 S t r e p t o v e r t i c i l l i u m 红球菌属 R h o d o c o c c u s 芽胞杆菌属 B a c i l l u s 棒状杆菌属 C o r y n e b a c t e r i u m 等 其中链霉菌属中产生胆固醇氧化酶的 菌种最多 近年来国内外研究较多的是来源于短杆菌属和链霉菌属的胆固醇氧化酶 它们 已被日本的T o y o b o 公司和K y o w a h a k k o 公司用于工业化生产 除诺卡氏菌N o c a r d i ar h o d o c h r o u s 产的胆固醇氧化酶以外 l 其他微生物来源的胆 固醇氧化酶以F A D 作为辅基 接受电子进行氧化磷酸化 提供微生物细胞所需的能量 江南大学硕士学位论文 根据酶与F A D 的结合方式 可将胆固醇氧化酶分为非共价结合 I 型 和共价结合 I I 型 两种形式 链球菌S t r e p t o m y c e ss p S A C 0 0 产生的胆固醇氧化酶 S C O 和来源于 短杆菌B r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m 的胆固醇氧化酶 B C 0 1 属于I 型酶 来源于另一株 短杆菌B r e v i b a c t e r i u m 的胆固醇氧化酶 B C 0 2 属于I I 型酶 1 2 J G a d d a 等人 1 3 对这两 种酶的性质进行比较发现 I 型酶和I I 型酶都具备黄素蛋白氧化酶特性 即具有与亚硫 酸盐形成黄素加合物的能力以及光还原形成热动力学稳定的红半醌阴离子的能力 但 型酶产生黄素加合物的速度是I 型酶的5 0 倍 I I 型酶的氧化还原电势中点比I 型酶的 高 1 0 0 m V 另外 两类酶中F A D 的氧化型 半醌型以及全还原型的光谱特性均有差异 不同微生物来源的胆固醇氧化酶 其分布及其酶学性质各有差异 有的微生物产生 的胆固醇氧化酶吸附在细胞膜上 而有的微生物产生的胆固醇氧化酶能够直接分泌到发 酵液中 胆固醇氧化酶分子量一般在3 0 k D 到6 0 k D 之间 而红球菌属l j 4 J 细胞膜上的胆 固醇氧化酶的分子量较大 约为8 0 k D 胆固醇氧化酶耐受酸碱范围在p H 4 1 1 之间 最适反应p H 范围一般为中性偏碱 耐热性最好的是假单胞菌S T 2 0 0 P s e u d o m o n s ss p S T 2 0 0 产胆固醇氧化酶 其在6 0 C 条件下酶活最高 5 热稳定性较好的还有胆固醇短 杆菌A T C C 2 1 3 8 7 胆固醇氧化酶 在5 0 和6 0 保温3 0 分钟 相对酶活力分别为1 0 0 和8 1 t 1 0 1 去垢剂脱氧胆酸钠和T r i t o nX 1 0 0 一般不会使胆固醇氧化酶失活 但一些金属离子 如铁 铜 银等会不同程度的抑制它的活性 在含l m m o l L 汞离子或银离子的溶液中 酶的氧化活力下降5 0 1 0 0 用谷胱甘肽或半胱氨酸可以解除或部分解除重金属离子 对酶活的抑制作用 说明胆固醇氧化酶的氧化活性中心有巯基存在 6 1 1 1 2 胆固醇氧化酶的应用前景 微生物来源的酶在很多领域都有广泛的用途 如淀粉酶 蛋白酶等 胆固醇氧化酶 由于在来源方面受限 其应用一直比较有限 近年来 随着高产菌种的选育以及基因工 程方面的研究取得了很大进步 胆固醇氧化酶的应用前景被广大学者关注 目前胆固醇 氧化酶在日本 美国等国家已进行商品化生产 它的应用范围己从最初的临床诊断试剂 扩展到食品加工 制药工业 生物化学和生物抗虫等领域 1 1 2 1 医药行业 临床证明 血清中胆固醇浓度和冠心病等心脑血管疾病的发病率呈正比关系 因而测 定血清中胆固醇的含量就成了临床诊断中一个重要的参考指标 胆固醇氧化酶可将胆固 醇氧化为胆甾 4 烯 3 酮和H 2 0 2 通过检测产物的量可以计算出底物胆固醇的量 将胆 固醇氧化酶 胆固醇脂酶和过氧化氢酶三酶合一的分析方法已被广泛应用于血浆总胆固 醇含量的临床诊断 还可将这三种酶做成酶电极 能反复使用且方便 目前国外研究的 热点是酶固定化生物传感器 与微电子技术相结合 开发可以反复使用的微量检测仪器 或家庭使用的简便检测试剂 7 1 胆固醇氧化酶氧化胆固醇的产物胆甾 4 烯 3 酮可以作为治疗肝炎 抗肥胖 防止 皮肤角质化的药物 同时可以作为前体物质合成激素类药物 本实验室曾初步探讨了胆 第一苹绪论 甾 4 烯 3 酮的生物转化方法 在正辛烷作为有机相的两相反应体系中 以胆固醇氧化 酶催化氧化胆固醇制各胆甾 4 烯 3 酮 l8 1 此方法具有转化率高 产物单一 反应条件 简单等优点 利用合适的反应器可以尝试较大规模的制备 最新研究表明 编码胆固醇氧化酶的基因能触发抗生素多马霉素的合成 胆固醇氧 化酶是多马霉素合成的信号蛋白 l 引 在抗生素的生产中具有重要的作用 胆固醇氧化酶可作为一种工具酶 用于探测3 p 羟固醇的空间结构以及作为细胞膜 或其他结构胆固醇的探针 例如 胆固醇氧化酶作为不可渗透膜的探针 有选择地作用 于线粒体外膜的胆固醇 用于研究肾上腺细胞线粒体的胆固醇的结构 以便深入研究肾 上腺皮质激素的体内合成过程 2 0 1 通过胆固醇氧化酶作用 还可确定生物膜胆固醇的分 布以及胆固醇与其他膜脂的相互作用 1 1 2 2 食品行业 利用微生物及其产生的胆固醇氧化酶可以有效地降低乳 肉 蛋等食品中的胆固醇 含量 预防心脑血管疾病的发生 如本实验室的吕陈峰口1 2 2 等优化了胆固醇氧化酶转化 蛋黄胆固醇的工艺 产物单一且对身体无毒害 此方法用于生产低胆固醇且具有保健功 能的蛋黄制品具有较大的潜在经济效益 目前研究的热点是将产胆固醇氧化酶的基因工 程菌株直接用于奶制品生产来控制胆固醇的含量 如将胆固醇氧化酶基因c h o A 转化奶 酪乳酸杆菌 L a c t o b a c t e r i ac a s e i 和嗜热链球菌 S t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s 使这些奶制 品生产菌具备氧化胆固酶的能力四J 研究不限制饮食 不干扰人体正常代谢 不影响食 品风味 经济实用的减少胆固醇吸收的食品及其加工方法 已成为当前重要的研究课题 1 1 2 3 农业方面 胆固醇氧化酶 c h o M 可使鳞翅目昆虫内消化道的上皮细胞破裂 抑制昆虫的生 长发育特别是对棉籽象鼻虫的幼虫 是非常有效的杀虫剂 C h oHJ 2 4 等人将链霉菌的C O D 基因克隆到烟草中 获得转基因的愈伤组织 其 C O D 的活性比原组织提高8 倍 在1 9 9 5 1 9 9 6 年之间 C o r b i nDR 等人先后在3 篇专利 上介绍了将C O D 基因转到植物或烟草中 以获得抗鳞翅目昆虫的转基因新植株 综上所述 胆固醇氧化酶是一种多功能酶 在食品 医药 和农业等方面具有广泛 的应用前景和很大的开发价值 1 2 红色细菌产生胆固醇氧化酶的概况 从前面胆固醇氧化酶产生茵的来源来看 目前报道的产胆固醇氧化酶的细菌菌落从 颜色上分为两种 一种产色素 一种不产色素 其中常见报道的红色菌属有 一种为诺 卡氏菌属 N o c a r d i a 另一种为红球菌属 R h o d o c o c c u s 红平诺卡氏菌 N o c a r d i ae r y t h r o p o l i s 在培养1 4 小时后 从菌落中央开始断裂 这时有的菌丝已有3 个短分枝 产生的节段时常平行 周缘菌丝继续生长 偶尔分枝 不产生球菌状细胞 红平诺卡氏菌部分抗酸 在营养琼脂平板上 菌落光滑 隆起 呈 粉灰色 边缘完整 在马铃薯甘油琼脂平板上 基丝干 堆叠 颗粒状 呈灰珊瑚苍色 江南大学硕士学位论文 橙色 在牛奶中 有淡粉色皮膜 继1 9 4 8 年首次分离得到产胆固醇氧化酶的红平诺卡 氏菌后 1 9 7 3 年 R i c h m o n dW 2 5 J 等分离出一株产胆固醇氧化酶的红平诺卡氏菌 并对 C O D 的分离纯化进行了研究 马红球菌原称为马棒状杆菌 曾归于棒状杆菌属 但近年来国外学者对其细胞壁进 行分析后建议列入红球菌属 命名为马红球菌 该菌为马 猪 牛等动物的致病菌 近 年来 从人类感染性标本中检出本菌的报道呈上升趋势 被认为是人类机会致病菌 本 菌生长较为缓慢 产生橙红 桔红色素 菌落呈粘液状 菌体以卵圆形 短杆状为主 呈多形态性是其特征 生化反应不活泼 不能分解任何糖 醇类 触酶为阳性 马红球 菌菌落呈粘液状且产生鲜艳的橙黄 桔黄色素 此特征易与其他类似菌区别 其次 不 发酵任何糖类可以与棒状杆菌属区别 动力阴性 不发酵糖醇 不能水解七叶苷可以与 李斯特菌区别 而触酶阳性 H 2 S 阴性可以与丹毒丝菌区别 触酶阳性 不分解任何糖 醇类 不能水解七叶苷可区别于肠球菌 2 6 J 2 0 0 7 年中国农业大学张彬等利用以胆固醇 为唯一碳源的选择性培养基 从豚鹿粪便样品中分离出1 株降解胆固醇良好的菌株 经生 理生化鉴定和1 6 S r D N A 基因序列分析 该菌株为马红球菌 R h o d o c o c c u se q u i 2 7 J 国外对 马红球菌产胆固醇的研究比较早 19 8 9 年 W a t a n a b eK 等对R h o d o c o c c u se q u N 0 2 3 所 产的胆固醇氧化酶进行了分离提取和性质研究 1 9 9 9 年 K r e i tJ 对R h o d o C O C C U S e q u G K lB 酬所产的胆固醇氧化酶进行了定性分析 1 3 细茵红色素的生物合成与分离提取 1 3 2 红色素的生物合成 自然界中存在很多种天然色素 其来源和分布非常广泛 且各类色素都有其特定的 生物合成途径 下面以类胡罗卜素为例阐述了色素的生物合成过程 类胡萝卜素是一类呈黄色 橙红色或红色的多烯类化合物 按其结构不同可分为胡 萝卜素和类胡萝卜素含氧衍生物 即碳氢型 只由碳 氢组成 和氧化型 由碳 氢 氧组成 两大类 其典型代表分别为B 胡萝卜素和黄体素 所有类胡萝卜素在形式上都可以由1 1 个共轭双键及2 个非共轭碳 碳双键构成的番茄红素为基础结构通过氧化 氢化 脱氢 环化 以及碳架的重排 降解而衍生 目前 类胡萝卜素有6 0 0 多种 其中能作为维生素A 原的有3 8 5 0 种之多弘圳 细菌 真菌 微藻和高等植物均可合成类胡萝卜素 3 0 1 而且不少类胡萝卜素为所有 生物所共有 但不同生物在合成途径的细节及所积累的类胡萝卜素种类方面仍存在较大 的差异 如图1 1 可见 细菌与酵母 霉菌的类胡萝卜素合成途径基本一致 主要区别 在于八氢番茄红素的合成和番茄红素的环化在细菌中由两个酶 C r tB 和C r t 负责 而 在酵母和霉菌中仅需一个双功能酶 酵母中为C r tY B 霉菌中为C a rR A 或C a rR P 且P 可 完成 高等植物类胡萝卜素合成的分工相对较细 如细菌 酵母和霉菌中仅需一个酶就 可完成八氢番茄红素向番茄红素的转化 而在植物中则需P D S Z D S 和C R T I S O 三个 酶共同参与 第一章绪论 图1 1 类胡萝卜的生物合成途径 F i g 1 1B i o s y n t h e s i so fc a r o t e n o i d s 注 C a r C r t 类胡罗卜素 P S Y 八氢番茄红素合成酶 P D S 八氢番茄红素脱饱和酶 Z D S 胡 罗卜素脱饱和酶 C R T I S O 类胡罗卜素异构酶 L B C Y 番茄红素B 环化酶 L E C Y 番茄红素 环化酶 E C H 胡罗卜素 环羟化酶 B C H 胡罗卜素p 环羟化酶 1 3 3 影响红色素生物合成的因素 现在已有许多种类的微生物被发现可以产生天然色素 如需氧光合作用的原核生物 不需氧的向光性细菌 不产孢子真菌和酵母 非致病性和植物病原体细菌 耐盐的淡水 藻类等说明产天然色素的微生物资源是非常丰富的 3 用微生物规模化生产天然色素主要通过化学手段有效刺激色素的生物合成 促进生 物体内天然色素的积累 许多微生物已经被报道能产生天然色素 但是只有 d 部分实现 工业化 目前杜氏盐藻类是1 3 胡萝卜素最闻名的微生物资源 同时雨生红球藻和法夫酵 母 生产虾青素 也是目前仅有的具有大规模工业生产酮类胡萝卜素的微生物系统 三孢 布拉霉已经被俄罗斯用于工业生产1 3 胡萝卜素多年 3 2 1 改进天然色素的生物合成效率 可以增加其产量 不同的培养环境和培养基添加物可以提高微藻 真菌 细菌中的细胞 生物量和色素产量 1 3 3 1 培养基成分对微生物生产天然色素的影响 培养基为微生物的生长和积累代谢产物提供了碳源和氮源等营养物质 它们是色素 物质的结构构成成分 培养基成分还影响色素的合成方向的不同 目前国内外很多学者在 这方面做了大量的工作 尤其是对产类胡萝卜素的微生物的研究 如B u z z L r f P 以精馏浓 缩的葡萄液作为唯一碳源对粘红酵母生产类胡萝卜素 最佳条件下可获得类胡萝卜素 江南大学硕士学位论文 6 9 m g L 1 3 胡萝卜素1 1 0 01 tg L 他们还发现培养基中加入番茄汁有利于红酵母细胞 生物量和番茄红素产量的提高 培养基起始p H 中性偏碱有利于番茄红素的积累 1 3 3 2 物理因素对微生物生产天然色素的影响 光照 关于光照时间对微生物色素产量的影响 有两种光照诱导理论 一种通过光 照刺激微生物生长来提高色素的产量 另一种是通过增加色素生物合成酶的酶活力 增加 色素细胞积累量来提高色素的产量 如产B 类胡萝b 素的杜氏盐藻类 就需要高强度的 光照以及盐抑制剂和营养抑制剂合成类胡萝b 烈M J 温度 温度可以改变色素的生物合成途径 会影响色素生产的酶浓度 有关温度对类 胡萝b 素生物合成的影响的研究多集中于杜氏藻属巴德威藻 粘红酵母 法夫酵母绿色 丝状菌 鲁氏毛霉 蓝藻等微生物p 4 通风 研究发现红曲霉生长 增强通气对色素的形成是有利的 S i m o v aED 发现在 强力通风1 3 L L m i n 下可有效地最大获得类胡萝b 素1 2 4 m g L 重要的是在这个共 生培养中 通风强度刺激了1 3 胡萝b 素的合成 可达到类胡萝卜素总数的6 0 t 3 5 J 不同添加物对微生物生产天然色素的影响 目前许多学者已研究证实 在微生物培养体系中添加有机物质可以影响色素的合 成 女l l t 3 4 J 乙醇 甲醇 异丙醇 乙烯 乙二醇 萜烯 1 3 紫罗酮 异烟肼 胺盐 生物碱 抗菌素 甲基庚烯酮 嘧啶 咪唑 脱落酸 青霉素 氯霉素等 有报道 3 6 1 发现当二苯胺的含量为1 0um o l 时 可提高深红酵母和粘红酵母中类胡萝b 素量 其中 尼古丁是一种重要的抑制剂 它可在各种微生物中抑制环化反应 现被大量用于类胡萝 b 素生物合成途径的研究中 无机盐和金属离子对微生物的色素生物合成也有影响 特别是金属阳离子 如 钾 镁 钠 钙 铁 钴 铜 钡 锰等 甚至重金属 镧 铈 铷 3 4 1 此外 B h o s a l eP 等 3 7 发现氯化钙 氯化铵 氯化锂 碳酸钠可以使多食黄杆菌产类胡罗b 素的产量提高 15 2 0 1 3 4 红色素的分离提取方法 溶剂提取法 最常用的溶剂提取法是根据原料中被提取成分的极性和共存杂质的理 化特性的不同 遵循相似相溶原则 使有效成分从原料固体表面或组织内部向溶剂中转 移的传质过程 溶剂提取法包括浸渍法 渗漉法 煎煮法和回流提取法 以水为溶剂提 取天然色素可用浸渍法和煎煮法 前者适用于有效成分能溶于水 对湿 热稳定且不易 挥发的原料 用有机溶剂提取可采用回流提取法 溶剂法虽然一直是最传统的方法但是 由于其所用溶剂往往是丙酮 二甲亚砜等对环境有害物质 所以其越来也越被淘汰 超声波提取 超声波是一种弹性波 它能产生并传递强大的能量 大能量的超声波 作用于液体后 在振动处于稀疏状态时 声波在植物组织细胞里比电磁波穿透更深 停 留时间也更长 使液体被击成很多的小空穴后 发生瞬间闭合 产生高达3 0 0 0 M P a 的 瞬间压力 即产生空化作用 导致植物细胞破裂 此外 超声波还具有机械振动 乳化 扩散 击碎等多级效应 可使植物中有效成分转移 扩散及提取 因此 用超声波提取 色素 操作简便 快速 无需加热 提取效率高 速度快 效果好 且结构不被破坏 第一苹绪论 李云雁 宋光森 38 J 运用超声波技术从板栗壳中提取棕色素 并与常规方法进行了比较 结果显示超声波提取省时 节能 提取率高 微波提取 微波技术是利用电磁能等微弱能量对食品及农产品等进行加工 贮藏等 处理的一种高新技术 具有升温快 易控制 加热均匀 节能等优点 可强化浸取过程 缩短周期 降低能耗 减少废物 提高产率和提取物纯度 操作费用低 利于环保 有 良好发展前景 在微波场中 微波能的吸收差异使萃取体系中某些组分被选择性加热 萃取物从体系中被分离出 并进入到介电常数较小 微波吸收能力相对较差的萃取剂中 由于微波热效率较高 升温快速而均匀 故显著缩短了萃取时间 提高了萃取效率 索 氏萃取通常需1 2 1 4 h 的处理时间 需要消耗上百毫升有机溶剂 而微波萃取可将萃取 时间缩短到0 5 h 内 有机溶剂的消耗量降至5 0 r a L 以下 目前 微波技术用于提取色素 的报道不断出现 涉及生物碱 黄酮 单宁类等物质 黎或等人研究了微波提取野菊花 黄色素 提取率从8 8 6 提高到9 1 1 1 3 圳 酶法 植物色素往往被包裹在细胞壁内 而大部分植物的细胞壁由纤维素构成 用 纤维素酶可以破坏B D 葡萄糖苷键 使植物细胞壁破坏 有利于成分提取 根据此原理 在提取植物成分前先用纤维素酶酶解 使植物细胞壁破坏后再进行提取 可提高活性成 分的提取率 而不管是否使用酶 提取物的成分一致 这说明酶解没有破坏植物的成分 超临界流体萃取 S F E 超临界流体萃取是利用其介于气体和液体之间的流体进行 萃取 该流体具有优异的溶剂性质 粘度低 密度大 流动性 传质 传热和溶解性能 均较好 在较高压力下 将溶质溶解于流体中 然后降低流体溶液的压力或升高温度 使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降 溶解度降低而析出 目前在超临界流体萃取 技术中使用最普遍的溶剂C 0 2 是无毒 不燃和化学惰性的物质 价格便宜 纯度高 对 环境无污染 与传统工艺相比 操作温度低 工艺简单 效率高且无污染等 目前国内 对色素提取的研究都还停留在以上一些提取方法 但是国外的研究都已经转向了超临萃 取 R o z 五 N L E 4 0 研究了用C 0 2 超临界流体萃取方法从番茄副产品中提取番茄红素 结 果表明 在8 6 3 4 4 7 8 6 k P a 条件下得到了3 8 8 的最大提取率 色素提取技术的发展经历了从原始物料破碎到普通溶剂浸取 再到以物理辅助技术 强化浸提阶段 其技术要求高效 保持成分的原状态性 对环境无污染 使得分离方法也 越来越高效 自动化 随着人们对高质量生活的追求 对天然色素的研究会更加广泛 1 4 本课题研究的立足点和主要内容 美国和日本对胆固醇氧化酶研究比较深入 尤其是日本 已经率先实现了基因工程 胆固醇氧化酶的商品化 我国对胆固醇氧化酶的研究起步比较晚 研究机构也比较少 本实验室曾从土壤中分离了一株产胆固醇氧化酶的短杆菌 从此便开展胆固醇氧化酶的 相关研究 经过多次诱变育种 产酶能力有较大的提高 4 并在分离纯化 4 2 4 3 1 应用 等方面取得了一定的成果 近几年开始基因方面的研究i 纠引 已扩增到了 B r e v i b a c t e r i u ms p D G C D C 8 2 的完整基因 G e n b a n k 登录号为D Q 3 4 5 7 8 0 并对胆固醇 氧化酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达进行了研究m J 7 江南大学硕士学位论文 本文主要对本实验室保存的一株红色高产胆固醇氧化酶的菌株进行了产酶和红色 素相关性的研究 试图利用这种相关性建立一种筛选高产胆固醇氧化酶菌种的筛选方 法 为进一步的定向进化奠定基础 围绕上述目标 将进行以下工作 1 红色菌株产酶和产色素稳定性研究 以及红色菌株的生理生化和1 6 Sr D N A 鉴定 利用诱变引发退化 筛选退化株 研究红色菌株产酶和产色素关系 2 研究发酵条件对菌种产酶和产色素的影响 3 提取红色菌株红色素 并进行结构分析和代谢流分析 初步探讨了C O D 与红色 素的关联性 第二章红色菌株产C O D 和红色素相关性的初步确定 第二章红色菌株产C O D 和红色素相关性的初步确定 为了研究红色短杆菌产C O D 和红色素的关联性 首先必须观察红色短杆菌生成C O D 和红色素的遗传稳定性 在确认其存在相对的遗传稳定性的基础上 采用物理复合化学 诱变的手段 强行改变该菌株的色泽形态 以观察色泽减弱的变异株产生C O D 的水平是 否发生变化 进而评价其产生C O D 和生物合成红色素的关联性 多种微生物能够产生胆固醇氧化酶 目前已经报道的几种微生物产胆固醇氧化酶水 平分别为 15 0 0 U L A 厂t h r o b a c t e r s i m p l e x 4 7 1 5 0 U L B r e v i b a c t e r i u ms p h a e r i c u s 删 1 3 5 u m P s e u d o m o n a ss p 和2 9 0U L R h o d o C O C C U Ss p L 4 刿 短杆菌B r e v i b a c t e r i u ms p C C T C CM 2 0 1 0 0 8 为本实验室从土壤中分离得到 并且采用紫外线 亚硝基胍 叫C o 等 一系列诱变方法处理后 以胆固醇为诱导物和碳源 产酶方式由部分分泌型变为完全分 泌型1 50 1 产胆固醇氧化酶活力为5 0 0 U L 为了进一步提高酶活 降低血清胆固醇检测试 剂盒成本 采用了新的诱变手段对该菌株进行诱变 超声波具有高频率 短波长 方向性好的特点 并且具有较小的衍射现象 可以在 细胞表面发生折射 超声波对微生物具有较强的生物影响 作用机理很复杂 但是主要 的影响可能是空穴效应1 5 随着气泡在瞬间破灭 将产生极短暂的强压力脉冲 局部热 点和剪切力 这些效应能破碎细胞 混合蒸汽及产生自由基 所以在超声波作用下 当 微生物染色体复制时 胸嘧啶易发生错配 产生诱变效应 有报道称利用超声波及其相 关生物特性处理工业微生物取得了较好的效果p 引 在本实验室以前关于超声波的研究 中 以m o n a s c u ss p 为出发菌株利用超声波诱变处理后 筛选到一株M o n a s c u sp i g m e n t 和 M o n a c o l i nK 的高产菌株 5 引 亚硝基胍是强的化学诱变剂 本试验前人利用亚硝基胍和 超声波联合处舰v i b a c t e r i u ms p D G C D C 8 2 促进了微生物细胞群的均匀分散和细胞 膜的通透性 提高了突变率 经诱变后在以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上 得到一株 红色突变株B r e v i b a c t e r i u ms p D G C C N 2 5 与出发菌株相比产酶活力提高1 4 0 说明这 种超声波联合亚硝基胍的物理化学复合诱变方法对短杆菌有明显的诱变效应 本实验对实验室保藏的菌种中红色高产菌株D G C C N R 进行了遗传稳定性 以及生 理生化和1 6 Sr D N A 特征鉴定分析 在研究过程中发现这株红色菌株的产酶和红色素含 量有一定的偶联关系 为了证明这种关系 本实验通过对红色素的粗提取研究了这株菌 产酶和红色素的关系 以及研究了红色素和发酵液中底物胆固醇 胆固醇代谢产物胆甾 4 烯 3 酮的关系 实验证明红色菌株D G C C N R 产酶与产红色素成正偶联关系 又用复 合诱变的方法验证了这种关系 确立了菌种产酶与红色素的关系 2 1 材料 2 1 I 菌种 产胆固醇氧化酶红色菌株D G C C N R 本实验室保藏菌种 2 1 2 主要实验仪器 9 江南大学硕士学位论文 H 6 6 M C 型超声仪 U V 7 5 4 紫外可见分光光度计 2 1 3 主要试剂 亚硝基胍 N T G 辣根过氧化物酶 2 1 4 培养基 无锡超声设备有限公司 上海精密仪器 德国F l u k a 公司 上海双向西巴斯科技发展有限公司 完全培养基 g L 牛肉膏3 蛋白胨1 0 N a C I5 琼脂2 0 蒸馏水1 L p H 7 5 种子培养基 g L 牛肉膏3 蛋白胨1 0 N a C l5 蒸馏水1 L p H 7 5 发酵培养基 g L 胆固醇3 酵母膏8 N a C l l C H 3 C O O N H 42 K 2H P 0 40 2 M g S 0 4 7 H 2 00 0 5 F e S 0 4 7 H 2 00 0 1 C a C l 20 1 吐温 8 03 m L 蒸馏水1L p H 7 5 2 1 5 胆固醇氧化酶检测液 溶液A 4 氨基 安替比林 l m m o U L 苯酚 6 m m o l L 叠氮钠 0 2 9 L 过氧化物 酶 5 0 0 0 U L 磷酸钾缓冲液 2 5 m m o l L p H 7 5 溶液B 胆固醇 8 2 6 m g m L T r i t o n X 1 0 0 4 2 6 异丙醇为溶剂 2 2 实验方法 2 2 1 培养条件 完全培养基斜面活化4 8 h 接一环到5 0 m L 种子培养基中 3 0 2 0 0 r r a i n 振荡培 养1 4 h 发酵条件 5 0 0 m L 三角瓶装液量1 0 0 m L 接种量1 0 3 0 2 0 0 r m i n 振荡培 些 乔 2 2 2 胆固醇氧化酶活的测定 胆固醇氧化酶酶活测定采用比色法 其原理是 胆固醇在C O D 的催化下分解成一 分子的胆甾4 烯 3 酮和一分子的H 2 0 2 H 2 0 2 在过氧化物酶的作用下分解 可使4 氨基 安替比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物 它在5 0 0 n m 处有最大吸收峰 5 3 1 通过测 量反应液在5 0 0 n m 处的吸光值 可定量测定胆固醇的氧化量 从而计算出胆固醇氧化酶 的酶活单位 3 m L 溶液A 1 5 0 1 x L 溶液B 5 0 此酶液 3 7 C 反应5 分钟 沸水浴3 分钟 于 5 0 0 n m 测吸光值 酶活 U m L I 6 8 3 2 x A 5 0 0 2 2 3 残留胆固醇测定 取0 2 m L 发酵液于4 m L 的离心管中 加入3 8 m L 无水乙醇 1 0 0 0 0 r r a i n 离心3 分钟 各取1 0 m L 上清液转移到相应的试管中 取0 0 8 m g m L 胆固醇工作液1 0 m L 转 移到第二个试管中 用作标准 取1 0 m L 乙醇加入到第三个试管中 用作空白 向3 个 试管中缓慢加入1 0 m L 的硫磷铁试剂 轻轻振荡均匀置室温3 0 分钟 所生颜色在 d 时内稳定 将上述各试管中的有色溶液于5 5 0 n m 下进行比色测定 作记录 胆固醇 第二章红色菌株产C O D 和红色素相关性的初步确定 m g m L A 待测样 A 标准样 1 6 2 2 41 6 Sr D N A 提取测定 D N A 提取方法 1 3 0 C 摇瓶培养1 4 h 取2 0m L 菌液4 0 0 0g 离心1 0m i n 收集细胞 用T E 洗涤一次 2 用2m LT E 缓冲液重悬菌体 加入5 m g 溶菌酶 2 0 0 止1 0 S D S 和3 0 此蛋白酶K 2 0m g m L 混合均匀 3 7 保温1 h 3 加入等体积氯仿 异戊醇 混匀 6 0 0 0g 离心1 0m i l l 4 为防止剪切力造成基因组D N A 断裂 用粗口吸管将上清转入另一离心管中 加入等 体积酚 氯仿 异戊醇混匀 6 0 0 0g 离心1 0m i l l 5 取上清 移至另一离心管中 加入2 倍体积冰冷乙醇 轻轻晃动至白色丝状D N A 沉 淀清晰可见 6 用吸管将D N A 缠绕其上 在7 0 酒精中清洗 7 用无菌牙签将D N A 从吸管上刮下 转入1 5m L 离心管中 8 室温下风干 加2 0 0 此T E 缓冲液溶解 作为扩增1 6 s r D N A 的模板 1 6 s r D N A 扩增 依据细菌1 6 Sr D N A 中最保守的序列设计并合成引物1 5 训 正向引 物 5 A G A G 兀T G A T C C T G 配T C A