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三类不同人群肠道大肠杆菌耐药性的比较研究作者：林鸿 吴聪明 蓝坚贞摘要：本文采用美国NCCLS推荐的纸片扩散法，对分离自与动物有不同接触水平的三类人群肠道的大肠杆菌进行了9种抗菌药物敏感性试验。结果三类人群肠道大肠杆菌耐药存在明显差异，其中以饲养员分离菌对9种抗菌药物的耐药率最高，学生人群分离菌的耐药率最低，屠宰人员分离菌介于二者之间，三人群分离菌对四环素、复方新诺明以及氨苄西林的耐药率最大，耐对头孢氨苄以及多粘菌素B几乎没有耐药性。三类人群对9种抗菌药物的耐药率变化趋势相近。关键词：大肠杆菌；药物敏感性；耐药性 抗生素使用一个不可避免的副作用就是耐药细菌的出现及传播。许多回顾性及前瞻性调查研究表明在抗生素使用后，不仅病原菌的耐药性水平，而且体内外的共生菌耐药性水平也会增加。共生菌是供应病原菌耐药基因的潜在贮库，因此其耐药水平是监控抗生素选择压力及预测病原菌耐药性趋势的一个良好指示器1。食品动物的耐药性共生菌可通过污染食品进入人体肠道共生菌2-8。因此监测不同来源如环境、动物、病人及健康人的指示菌（大肠杆菌及肠球菌）耐药性流行情况，可了解细菌耐药性的流行趋势，并检测耐药细菌或耐药基因在动物和人之间的转移。本文尝试对与动物接触程度不同的三类人群肠道分离大肠杆进行调查研究，以期了解人群肠道菌耐药性发生发展与动物接触程度之间的相关性，从而对动物源耐药菌经与人体直接接触传播进入人体的可能性。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1培养基 伊红美兰琼脂，批号20011123；普通肉汤，批号20020524；营养琼脂，批号20011215；MH琼脂，批号20020812。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.2肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管 型号 GYZ-11e，批号20020826，购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.3标准菌株 大肠埃希氏菌ATCC25922；金黄色葡萄球菌ATCC25923；铜绿色假单胞菌ATCC27853。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4药敏纸片 药物纸片种类及含药量见下表1，批号略，购自杭州天和微生物试剂有限公司。购买的每批药物纸片在使用前均按NCCLS要求用上述3种标准菌株进行质控，符合要求者方可使用，每周用标准菌株ATCC25922进行质控，符合要求者才可继续使用。1.2 试验方法1.2.1 标本采集 分别从19名猪场饲养员、11名屠宰人员以及15名学生采样。均以灭菌棉签采集直肠拭子标本，在采样同时以表格形式询问近期内（1年时间）抗菌药物服用情况。1.2.2菌株的分离 直肠棉拭子直接在伊红美兰琼脂平板上涂布，37，24小时培养后，从平板上随机挑取3-5个紫黑色带金属光泽的菌落进行纯培养及生化鉴定。1.2.3菌株的鉴定 按杭州天和微生物试剂有限公司介绍的肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管鉴定法进行。 即将分离纯化的可疑大肠杆菌菌株接种到系列细菌生化编码微量鉴定管内，37，24小时培养后，对菌株的生化反应结果进行判断并进行编码，按其编码检索肠杆菌科细菌生化编码表即可获得结果，对不确定的菌株进一步补充特定生化反应项目予以判定。表1 各种抗菌药物纸片含药量及判定标准抗菌药物名称纸片含药量（g/片） 抑菌圈判断标准（mm） 耐药（R） 中介（M） 敏感（S）氨苄西林101314-1617头孢氨苄301415-1718环丙沙星51516-2021链霉素101112-1415四环素301415-1819氯霉素301213-1718呋喃唑酮3001415-1617复方新诺明23.75/1.251011-1516多粘菌素B30089-11121.2.4药敏试验 整个药敏试验严格按照美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS1999)推荐的纸片扩散法操作程序进行。在营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于2ml普通肉汤管内，37培养16-18小时后，用MH肉汤调制菌悬液，使其达到0.5麦氏比浊管浊度。用灭菌棉拭子蘸取已调制好的菌悬液，于管壁上挤去多余液体，在已烘干的MH琼脂平板上均匀涂抹，平皿涂好后放置3-5分钟，待其培养基表面水份吸收干，即用无菌眼科镊将药敏纸片贴于平板上，每种药物贴2个纸片。37培养16-18小时后观察结果。用游标卡尺量取每种药物2个抑菌圈的直径，计算平均值，参照NCCLS1999公布的标准以敏感、中介或耐药3种形式对抑菌圈的大小作出解释，个别NCCLS1999没有列出但我国仍在临床上使用的药物（如呋喃唑酮等），按杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准进行解释。2 结果2.1 接受调查的所有人经答卷式询问，得到的结果他们至少在6个月以内都没有服用过任何抗菌药物。三类人群共分出134株大肠杆菌，其中学生人群41株，屠宰加工人员33株，饲养员60株。三类人群分离菌对9种抗菌药物的耐药率归纳为表2。从表2可看到，三类人群分离的大肠杆菌对9种抗菌药物的耐药率存在较大差异，其中学生人群分离菌对9种抗菌药物的耐药率最低，而饲养员分离菌最高，屠宰加工人员分离菌介于两者之间。9种抗菌药物中，三类人群分离菌对氨苄西林、四环素及复方新诺明都有较高的耐药率，而全部分离菌株对多粘菌素B都没有耐药性，对头孢氨苄的耐药率也很低，仅屠宰加工人员对其有9.1%的耐药率。表2 三类人群分离菌对9种抗菌药物的耐药率及中介率各类人群比率（%）环氨头四链氯多痢复学生人群（41株）耐药率2.44.9031.702.40036.6中介率7.358.52.426.87.3002.40屠宰人员（33株）耐药率9.142.49.145.512.1306.145.5中介率027.3024.2093.9330饲养人员（60株）耐药率23.269.6082.151.817.907.171.4中介率5.421.4251.814.314.31.828.602.2 将三类人群分离菌对9种药物的耐药率做成折线图(图1)进行比较,可明显看出各类分离菌对各类药物耐药的差异.但是折线走向基本趋于一致,差异较大的是各类分离细菌对头孢氨苄的耐药率.2.3 将三类人群分离菌中各型多重耐药菌株的比率进行做图（图2）比较。可看出，三类人群分离菌的各型多重耐药菌株的比率分布较离散，其中耐受抗抗菌药物最多的高达6种；比较三类人群,还可看到不耐药的菌株（0耐）以学生人群最高,屠宰人员次之,饲养人员最低；学生人群分离菌中最高可达4耐水平，而屠宰加工人员及饲养人员则可见6耐菌。2.4 将三类人群分离出的各菌株对9种抗菌药物的耐药谱进行归纳得表3。从表3可看出，学生人群分离菌有6种耐药谱型，屠宰加工人员分离菌有10种耐药谱型，饲养人员分离菌有18种耐药谱型；三类分群中都有相当比例的中介菌株存在，其中中介率最高的是学生人群，达46.34%，而饲养人员分离菌中的中介菌所占比例最低；仅13.3%，另外，学生人群及饲养员人群分离菌中还有敏感菌存在，而屠宰加工人员没有；各型多重耐药菌株中，耐受越多抗菌药物的菌株所占比率并不高，而占高比率的耐药谱是td及atd，即以同时耐受四环素及复方新诺明，和同时耐受四环素、复方新诺明及氨苄西林的菌株最多。学生人群加工人员饲养人员耐药谱比率耐药谱比率耐药谱比率catd2.44axtlfd3.03catsld8.32tld2.44catsd9.09atslfd1.67atd2.44axtfd3.03catsl1.67td17.06atsd3.03catsd10t9.76atd21.22catld1.67d9.76td3.03atsld1.67中介46.34ax3.03atsfd5敏感9.76t3.03catd1.67d3.03atsd10a3.03atld1.67中介45.45tsd1.67敏感0ats5atd15ts1.67td8.32at3.33as1.67t1.67中介13.33敏感5 注：c 环丙沙星； a 氨苄西林； x 头孢氨苄； t 四环素； s 链霉素； l 氯霉素；f 呋喃唑酮；p 多粘菌素B； d 复方新诺明；中介 至少对1种抗生素不敏感；敏感 对9种抗生素全敏感3 讨论3.1 三类人群分离菌的药物敏感性试验结果表明，人群与动物接触密切程度与其体内肠道菌耐药性高低有关系。饲养人员与动物接触最为密切，耐药性动物肠道菌可通过与人的直接接触而转移至人，因此三类人群中以其分离菌的耐药率最高；屠宰人员与饲养员相比可能直接接触活畜禽的机会少一些，但也显著高于一般学生人群相比，因此其分离菌的耐药率高于学生人群是合理的。3.2 三类人群分离菌对同一种抗菌药物的耐药率高低虽然差异较大，但对9种抗菌药物的耐药率折线图却有相近的走向，即三类人群分离菌都对养殖业常用作饲料添加药的四环素类以及磺胺类药物有相对较高的耐药率，而对几乎不用的多粘菌素B及头孢氨苄的耐药率相当低，说明动物源耐药菌或其耐药基因在人与动物的职业性接触过程中是存在传播的可能性，不过其传播的速度应不太快。3.3三类人群分离菌的多重耐药菌分布较离散，不集中，其原因不得知。但学生分离菌以不耐药菌（包括敏感和中介菌）为主，占50%以上，其它耐药菌（包括1-4耐）占约50%；从屠宰加工人员及饲养人员分离的大肠杆菌不耐药菌所占比例也较大，但它们在1-6耐多重耐药菌位置都有分布。3.4 分离菌的耐药谱型，以学生人群最少，饲养人员最多，屠宰加工人员介于二者之间，这也符合职业人群肠道菌耐药性产生与动物接触的关系。【参考文献】1Anthony. E .van den Bogaard, et al.2000. Epidemiology of resistance to antibiotics Links Between animals and humans International Journal of Antimicrobial Agents, 14: 327-3352Fey.P.D.T.J.Safranek,M.E.Rupp,E.F.Dunne,etal.2000.Ceftriaxone-resistant salmonella infection acquired by a child from cattle. New Engl. J.Med,342:1242-12493 Fone D.Land R M. Barker. 1994 Association between human and farm animal infections with Salmonella typhimurium DT104 in cattle Herefordshire. Comm Dis .Rep . 4: R136-1404Hunter,J .E.,M .Bennett,C. A.Hart,et al.1994. Apranmycin-resistant Escherichia coliisolated from pigs and a stockman . Epidemiol . Infect. 112:473-4805Nijsten, R., N.London, A. van den Bogaard,et al. 1996. Resistance facecal Escherichia coliisolated from pig farmers and abattoir workers . Epidemiol. Infect. 113:45-526Ven Bogaard .A .E, L. Jensen, et al. 1997. Vancomycin-resistant enterococci in turkeys and farmers, New Engl. J . ,Med. 337: 1558-15597Levy ,S. B,.G B .FitzGerald and A.B Macone. 1976. Changes in the intestinal flora of farm personnel after introduction of a terracycline-supple