胎儿角膜深低温保存对FASFASL蛋白表达的影响.doc

胎儿角膜深低温保存对FAS/FASL蛋白表达的影响作者：马路生单位：中国山东省烟台市，青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院眼科【摘要】研究细胞凋亡信号分子Fas和细胞凋亡因子FasL在新鲜及深低温保存后胎儿角膜的表达情况。方法：应用免疫组织化学SABC法对33例不同胎龄（5mo至足月）胎儿角膜石蜡标本切片后，分别进行了Fas和FasL 蛋白染色。结果：胎儿角膜细胞Fas蛋白及 FasL蛋白全为胞质和/或胞膜着色。33/33例角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞Fas蛋白阳性表达，经统计学分析，未发现不同月龄间有差异。33/33角膜上皮细胞及内皮细胞FasL蛋白阳性表达，经统计学分析，未发现不同月龄间有差异，角膜基质细胞FasL蛋白的表达为0/33。新鲜角膜和冷冻保存后角膜的Fas，FasL蛋白阳性表达量经统计学分析无差别。结论：新鲜和深低温保存后的5mo至足月龄胎儿角膜均可见Fas，FasL蛋白的表达。其中Fas在角膜上皮、基质和内皮细胞均表达，FasL在角膜上皮、内皮细胞表达，而基质细胞不表达。深低温保存对胎儿角膜Fas/FasL蛋白表达无影响。 【关键词】 Fas蛋白 FasL蛋白 凋亡 角膜0引言 细胞凋亡是深低温保存过程中角膜细胞丧失的重要原因，Fas/FasL是新近发现的与角膜细胞凋亡密切相关的一对基因，深低温保存能否促进人角膜Fas/FasL表达的增加，目前尚未见报道。鉴于成人角膜来源困难，我们选取胎儿角膜作为研究对象，对此进行了初步研究。1材料和方法1.1材料 青岛医学院第二附属医院眼库1998/1999年收集胎儿角膜33例，男胎21例，女胎12例，5mo龄6例，6mo龄6例，7mo龄6例，8mo龄5例，足月龄10例。平均（7.17±1.77）mo，将角膜一分为二，一半经由简易二步法深低温保存1，复温后行40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm切片，另一半则为新鲜标本直接用 40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm切片。角膜冷冻时间从1wk10mo，平均冷冻时间为（5.12±3.47）mo。Fas,FasL蛋白染色所需试剂,采用武汉博士德公司分装的即用型FAS试剂盒和FASL试剂盒。深低温保存角膜所需试剂,主要有二甲基亚枫、人血白蛋白及液氮。1.2方法 采用即用型SABC 法。阳性对照：用Fas，FasL试剂盒中自带阳性对照片做阳性对照；阴性对照：用PBS代替一抗作为阴性对照。以细胞膜和/或细胞质有清晰棕黄色颗粒着色为阳性染色细胞，胞膜或胞质无清晰棕黄色颗粒或无着色为阴性。在同一放大倍数下，根据阳性细胞的分布范围，分为0：阳性细胞数为0%；1：1%25%；2：26%50%；3:51%75%；4:76%100%。每张切片随机取3个视野，上皮、基质和内皮分别统计。统计学处理：采用SPSS10.0软件，根据资料性质，分别采用完全随机设计资料的方差分析和t检验。2结果2.1 Fas，FasL蛋白表达 Fas/FasL 蛋白阳性染色主要定位于细胞膜和细胞浆，呈棕黄色，而细胞核不着色,于是着色细胞便出现浆膜着色而核空的现象。Fas蛋白在角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞均有表达，FasL蛋白仅在角膜上皮细胞和内皮细胞有表达。上皮细胞层以翼状细胞和基质细胞着色更为明显（图1）。2.2不同月龄及深低温保存的影响 阳性对照片可见明显的阳性细胞，阴性片未见细胞有棕黄色颗粒表达。本实验33/33 例胎儿角膜Fas蛋白在3层细胞均阳性染色，着色颗粒均匀一致弥漫分布于细胞质和细胞膜，但有些角膜其细胞膜和细胞质可见大量的着色颗粒，而有些角膜其细胞膜和细胞质的着色颗粒则较少或无。不同月龄角膜Fas 蛋白表达无差异,冷冻保存后Fas蛋白表达亦未见明显差异（表1）。本实验33/33例FasL蛋白阳性染色，角膜上皮细胞和内皮细胞均着色，着色颗粒均匀一致，弥漫分布于细胞质和细胞膜，其中有些标本其细胞质和细胞膜可见大量的着色颗粒，有些角膜其细胞膜和细胞质的着色颗粒则较少。所有角膜基质细胞均不着色。不同月龄间角膜FasL蛋白表达无差异,冷冻保存后FasL蛋白的表达亦无显著改变（表2）。表1胎儿角膜Fas蛋白表达情况（略）表2胎儿角膜FasL蛋白表达情况（略）2.3 Fas/FasL表达与性别关系差别无显著性（P>0.05）,胎儿角膜Fas/FasL蛋白表达与性别无关（表3）。表3胎儿角膜Fas/FasL表达与性别的关系（略）3讨论 Fas是新近发现的细胞凋亡的信号分子2,3，FasL是新近发现的细胞凋亡因子，二者构成了一条独特的细胞凋亡通路，在角膜细胞的凋亡过程中起重要作用。深低温保存为眼库的主要保存技术，其能否激活Fas/FasL细胞凋亡通道，增加保存过程中的角膜细胞凋亡数量，既往多见于动物实验，尚未见人角膜方面的报道4。 关于Fas/FasL在胎儿角膜是否表达，不同月龄间有无差异未见报道。本研究结果，5mo龄以后胎儿角膜Fas，FasL的表达率为33/33，33/33，经统计学分析5mo至足月龄间Fas/FasL表达率无差别(P>0.05)。本研究具体到各月份例数尚少，可能不能代表群体情况，但至少在本实验所用33例角膜标本未见差异。我们发现，从5mo龄胎儿角膜直至足月胎儿角膜上皮、基质和内皮细胞Fas均持续表达，FasL在角膜上皮和内皮细胞均持续表达。Wilson等5采用逆转录聚合酶链反应研究发现，新鲜及冷冻的人角膜上皮、基质、内皮细胞全有Fas蛋白，而FasL蛋白仅发现于角膜上皮和内皮细胞，在角膜基质细胞没有发现，与本研究结果相同。本研究结果提示，胎儿角膜已具备与成人角膜 相近的“免疫赦免的物质基础”，为胎儿角膜移植的临床应用提供理论基础。【参考文献】1王传富,鞠明诚,石珍荣,等.简易法深低温保存角膜的实验和临床评价.眼科研究 1990;8:2062092 Yonehara S, Ishii A, Yonehara M. A cellkilling monoclonal antibody (antiFas) to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J Exp Med1989;169:174717563 Trauth BC, Klas C, Peters AM. Monoclonal antibodymediated tumor regression by induction of