MTHFR基因与冠心病相关性调查研究实验记录.doc

MTHFRC677T基因与冠心病相关性调查研究实验记录DNA的提取一、试剂配制1. 溶血试剂: 0.32M蔗糖 55g 1MTris-cl(PH:7.5) 0.5ml 0.005M Mgcl2 1g1%TritoneX-100 5mg 加水至 500ml注：1MTris-cl(PH:7.5)：称取24.23gTris于200ml蒸馏水中，用浓Hcl调PH值为7.5。 1%TritoneX-100：量取2ml TritoneX-100原液，加蒸馏水至200ml。 溶血试剂的配制：称取55g蔗糖及1g Mgcl2置于大烧杯中，同时加入5ml1%TritoneX-100和500ul Tris-cl(PH:7.5)，使其充分溶解，定容至500ml。2. 细胞裂解液(STE)缓冲液: Tris-cl(PH:7.5) 10mmol/L Nacl 10mmol/L EDTA 1mmol/L 注：称取0.30285gTris，0.1461g Nacl及0.0731gEDTA，置于大烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至250 ml。3. TE缓冲液: Tris-cl(PH:7.4,7.5,8.0) 10mmol/L EDTA(PH: 8.0) 1mmol/L注：称取0.12114gTris及0.2923gEDTA，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至100 ml。4. 裂解液: STE 900ul 10%SDS 60ul蛋白酶K 12ul 注：10%SDS：称取20g SDS，置于小烧杯中，加蒸馏水使其充分溶解，定容至200 ml。5. 饱和酚、氯仿、 氯仿:异戊醇(24:1)6. 3molNaAC7. 无水乙醇、70%酒精,放入-20预冷二、DNA提取步骤:1.将血样(EDTAK3抗凝)从-40冰箱取出置室温下融化,同时将其编号记录.2.提取白细胞: 将血液到入50ml离心管中,用溶血试剂反复冲洗采血管,加入约20ml. 将50ml离心管盖紧瓶盖后,至于旋涡混匀器上充分震荡混匀. 将50ml离心管放入大离心机4000rpm离心15min,弃上清. 加20ml溶血试剂重复一次, 并4000rpm, 离心10min,弃上清,沉淀即为淋巴细胞.3.裂解白细胞: 向装有沉淀物的离心管中加入900ul STE, 60ul 10%SDS, 12ul蛋白酶K后,将沉淀重悬分别移入2个1.5mlEP管中. 55水浴锅中处理2h. 100煮沸7 min,然后立即放入-20冷却5 min.4.酚.氯仿抽提DNA. 向每个1.5mlEP离心管中加入等体积的酚(约480ul饱和酚),将盖子盖紧后颠倒混匀后12,000rpm, 离心5min,小心将上清移入新的离心管中. 加入等体积的氯仿:异戊醇液约480ul, 混匀后12,000rpm, 离心5min,小心将上清移入新的离心管中.5.乙醇沉淀DNA: 加入水相体积1/10的3molNaAc和2倍体积的冰冻保存的无水乙醇,充分混匀后放-30冰箱冷却30 min,取出后12,000rpm, 离心10min, 弃上清. 加入1ml70%酒精(-20预冷), 随即12,000rpm, 离心10min, 弃上清,至于4冰箱使其自然干燥. 次日将每管加入20ul的TE缓冲液保存.PCR扩增一、试剂配制 1.TagDNA聚合酶,10buffer，Mgcl2，dNTPs等购与华美生物工程公司北京分公司. 2.引物的合成:根据文献设计两对引物,序列分别为: Forward:5-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3 Reverse:5-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3 引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成,按合成后所提供的DNA的OD值配成1ug/ul浓度. 3.模板的制备:DNA提取物 4.电泳用琼脂糖：称取1g琼脂糖倒入50ml1TAE中，将三角瓶充分混匀后，放入微波炉中火段，3min将胶溶解，稍凉一下，加1ul10mg/ml溴化乙锭溶解并混匀，等稍凉后，倒入电泳槽中,使胶均匀的铺平，避免汽泡的产生。 5.50TAE电泳缓冲液:Tris 121g冰乙酸 28.55ml1molEDTA 25ml(PH8.0)加水至 500ml6.6上样缓冲液溴酚兰 0.25%40%蔗糖水溶液 50ml二、PCR反应体系：10buffer 2.5ul Mgcl2(25mMol) 1.5 ul 4dNTP(each2.5mMol) 2 ulP1 P2 each10mMol 2.5ul DNA模板2 ul TagDNA聚合酶 0.5ul ddH2O 14 ul 总反应体系为25ul 三、PCR反应条件：预变性 94 5min 变性 9430s 退火 63 30s 30个循环延伸 72 30s72延伸7min四、PCR反应结果： 配置2琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5ul，按5：1的比例与6上样缓冲液混合，加入加样孔中，于1TAE电泳液中电泳1h，在凝胶呈像仪下观察结果，廓增片段为198bp. Hinf-I酶切：一、 所用试剂：1. Hinf-I酶购于华美生物工程北京分公司，内包括BSA及与酶相应的10buffer缓冲溶液。2. 12%聚丙烯酰胺凝胶的配制：12%AA母液 10ml10%APS 75ulTAMED 5ul注：12%AA母液的配制： 30%AA母液 40ml 5%TAE 20ml 加ddH2O至100 ml二、 酶切体系： 10buffer 2ulBSA 2ul ddH2O 5.5ul Hinf-I 0.5ul(20U) PCR扩增产物 10ul 酶切体系为20 ul三、 酶切条件：将各种试剂按上述顺序小心的加入0.2ml离心管壁上，用手掌式离心机离心10s ,至于37恒温摇床上，44转摇3h，于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5h，于凝胶呈像仪下观察结果，记录酶切结果。四、 酶切结果： PCR 产物经Hinf-I酶切后产生3 种基因型分别为野生型C/ C (第3泳道)、杂合子突变型C/ T (第1和2泳道)和纯合子突变型T/ T (第4泳道) , T/ T 基因型、C/ C 基因型可见一条带, 分别