大肠埃希菌尿液分离株氨基糖苷类获得性耐药基因研究.pdf

作者单位 南京医科大学第一附属医院核医学科 赵凌 李殿富 医学检验科 赵旺胜 徐健 无锡市克隆遗传技术研究所 糜祖煌 通信作者 李殿富 细菌耐药 大肠埃希菌尿液分离株氨基糖苷类 获得性耐药基因研究 赵凌 赵旺胜 徐建 糜祖煌 李殿富 关键词 大肠杆菌 氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 大肠埃希菌是医院感染的常见病原菌 随着临 床抗菌药物的大量使用 该菌不仅对喹诺酮类抗菌 药物的耐药率明显上升 对氨基糖苷类药物的耐药 问题也日趋严重 给临床抗感染治疗带来严峻挑战 有关对氨基糖苷类药物的耐药机制 传统观点认为 是细菌产生一种或多种针对抗菌药物的氨基糖苷类 修饰酶 年人们又发现另一种重 要的耐药机制 即细菌通过编码产生一类特殊的 甲基化酶 此酶几乎可使大肠埃希菌对所 有氨基糖苷类药物耐药 并能在人和动物间传 播 目前国内已有学者对阴沟肠杆菌 肺炎克雷 伯菌和鲍曼不动杆菌的氨基糖苷类修饰酶和 甲基化酶基因的存在及分布状况进行了 研究 为全面了解大肠埃希菌对氨基糖苷类药 物获得性耐药状况 笔者对 株大肠埃希菌分别进 行了 种氨基糖苷类修饰酶基因和 种 甲基化酶基因检测 并测定了其对临床常用抗菌药 物的敏感性 材料与方法 菌株来源 株大肠埃希菌均分离自 年 月 年 月南京医科大学第一附属医院 泌尿系统感染患者的尿液样本 男性 例 女性 例 年龄 岁 平均 岁 同一患者剔 除重复样本 全部菌株均使用 细菌鉴定系统 药物敏感性试验 采用纸片扩散法测定抗菌 药物的敏感性 种抗菌药物为头孢唑啉 头 孢呋新 头孢西丁 阿莫西林 克拉维 酸 氨曲南 头孢塞肟 头孢他 啶 头孢吡肟 哌拉西林 他唑巴坦 复方磺胺甲恶唑 亚胺培南 阿米卡星 左氧氟沙星 环丙沙星 庆大霉素 和妥布霉素 药物敏 感性试验纸片和水解酪蛋白 琼脂平板均为英 国 公司产品 根据 年美国临床实验室 标准化研究所 标准对抗菌药物的敏感性结 果进行判断 质控菌株为大肠埃希菌 细菌处理 挑纯培养菌落置入 离心管 内 内预置 蛋白酶 溶液 水浴 改 水浴 离心 上清液即为基因检测的模板液 冰箱 保存备用 基因检测 靶基因引物识别序列和目的产物 长度见表 各种靶基因 扩增体系 每反应体 系 引 物 引 物 缓 冲液 牛血清白蛋白 不计体积 超纯水 模板液 总反应 体积为 扩增热循环参数 预变性 个循环 最后一个 延长至 产物经 琼脂糖凝 胶电泳 出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳 性 检测试剂盒和阳性对照 由无锡市克隆遗 传技术研究所提供 中华临床感染病杂志 年 月第 卷第 期 表 靶基因引物识别序列和目的产物长度 酶名称基因名称 引物序列 产物长度 氨基糖苷类修饰酶 甲基化酶 阳性基因测序 测序在美国 公司 型 毛细管全自动测序仪上进行 委托上海博尚生物技 术有限公司完成 测得序列经比对 读序工具软件为 测序结果用 直接作 比对 统计学方法 采用 统计软件分析 率 的比较采用 检验 结果 药物敏感性试验 所有菌株对亚胺培南 头孢 他啶 哌拉西林 他唑巴坦 头孢西丁和阿米卡星的敏 感率较高 均在 以上 对头孢唑啉 头孢呋辛和复 方磺胺甲恶唑的敏感率只有 左右 而对环丙沙 星和左氧氟沙星耐药率均为 在氨基糖苷类药 物中 有 株大肠埃希菌对庆大霉素 妥布霉素和阿 米卡星耐药或中介 占 表 中华临床感染病杂志 年 月第 卷第 期 表 株大肠埃希菌对 种抗菌药物的敏感性 株 抗菌药物敏感中介耐药 头孢唑啉 头孢呋辛 头孢西丁 阿莫西林 克拉维酸 氨曲南 头孢噻肟 头孢他啶 头孢吡肟 哌拉西林 他唑巴坦 复方磺胺甲恶唑 亚胺培南 左氧氟沙星 环丙沙星 阿米卡星 庆大霉素 妥布霉素 氨基糖苷类获得性耐药基因检测 在 株大 肠埃希菌中 株 检测到氨基糖苷类修饰 酶基因或 甲基化酶基因 和 基因检出率最高 表 同时检出 种以上 基因的有 株 主要是 和 基因 也有 和 基因 或 和 基因 株未检测到氨基糖苷 类耐药基因 和 产物基因电 泳结果见图 和图 表 大肠埃希菌氨基糖苷类修饰酶基因和 甲基化酶基因检测情况 基因名称阳性菌株 氨基糖苷类修饰酶基因 甲基化酶 基因与氨基糖苷类药物的关系 株大肠埃希菌 中 有 株对氨基糖苷类 种药物耐药或中介 对 庆大霉素和妥布霉素均耐药的有 株 同时都含有 和 基因 而含 基因的 株菌 株 对氨基糖苷类 种药物均耐药 株大肠埃希 菌对氨基糖苷类 种药物均敏感 其中 株未检出 氨基糖苷类修饰酶基因和 甲基化酶基 因 株检出 和 或 基因 株检出 注 标准带 阳性对照 阴性对照 阳性样本 图 大肠埃希菌 产物电泳图 注 标准带 阳性对照 阴性对照 阳性样本 图 大肠埃希菌 基因 产物电泳图 或 基因 大肠埃希菌耐氨基 糖苷类药物与其产生氨基糖苷类修饰酶基因有直接 的关系 阳性产物测序 所有菌株检出 株 测序后经 比对分别为 株 和 株 图 抽取 株 基因阳性菌株测序 经 比对均与已 登录的 序列一致 图 抽取 株 基因 阳性菌株测序 经 比对均与已登录的 序列一致 图 讨论 自氨基糖苷类药物问世以来 氨基糖苷类药物 由 于 年首次发现 除天然不敏感 外 对大多数革兰阳性和阴性细菌均有较强的抗菌 作用 因此此类药物在临床医学和畜牧兽业得到广 泛应用 但过量使用导致耐药问题不断出现 细菌对 该类药物耐药是通过产氨基糖苷类修饰酶 甲基化酶所致 国内对大肠埃希菌及革兰阴性杆菌 氨基糖苷类修饰酶 甲基化酶已有较多关 注 但先前的研究所涉及的这 种酶基因种类 较少 笔者对大肠埃希菌进行了 种氨基糖苷类 中华临床感染病杂志 年 月第 卷第 期 图 大肠埃希菌 基因测序图 图 大肠埃希菌 基因测序图 图 大肠埃希菌 基因测序图 修饰酶基因和 种 甲基化酶基因检测 以 期进一步完善研究工作 国内文献曾报道 泌尿系统分离的大肠埃希菌 对喹诺酮类药物的耐药率逐年增加 本实验结果 也显示 株大肠埃希菌对环丙沙星和左氧氟沙星 的耐药率均为 不仅如此 大肠埃希菌对妥 布霉 素 庆 大 霉 素 的 耐 药 率 也 达 到 和 在这些耐药菌株中 大多数都检测到一种 以上氨基糖苷类修饰酶基因 尤其是对庆大霉素和 妥布霉素均耐药的菌株 同时含有 和 种基因 而在未检出耐药基因的 株菌株 中 有 株对庆大霉素 妥布霉素及阿米卡星均敏 感 实验结果表明 大肠埃希菌高水平耐氨基糖苷类 药物与其产生氨基糖苷类修饰酶基因有直接的关 系 因此 加强耐药菌的监测对指导和监督临床合 理用药极为重要 笔者研究显示 株大肠埃希菌中 有 株对 庆大霉素 妥布霉素和阿米卡星全敏感 而其中 株 均未检出氨基糖苷类修饰酶基因和 甲基 化酶基因 与敏感表型完全相符 有 株尽管检出 和 或 型氨基糖苷类修饰酶基因 但与敏感表型仍相符 这是因为各种氨基糖苷类药 中华临床感染病杂志 年 月第 卷第 期 物修饰酶其作用底物特性不同 对氨基糖苷类药物 修饰结果也不一样 可导致不同的耐药表型 和 型修饰酶基因只导致对链霉素 大 观霉素耐药 对庆大霉素等不耐药 还有 株检 出 或 型氨基糖苷类修饰酶基 因 其与敏感表型不符 一方面可能与耐药基因未诱 导而不表达有关 另一原因为 类整合子中耐药基 因盒的启动子位于整合酶基因中 故紧靠整合酶基 因的耐药基因 末端 易于表达或高表达 距离整 合酶基因稍远的耐药基因 末端 低表达或不表 达 这 株 或 型氨基糖苷 类修饰酶基因是否位于 类整合子 末端 有待于 以后进一步研究 值得关注的是本实验的大肠埃希菌检出 型 甲基化酶基因和 型氨 基糖苷类修饰酶基因 甲基化酶是 年被发现的一类能介导高水平氨基糖苷类抗菌药物 耐药的酶 能使氨基糖苷类抗菌药物的作用靶位 甲基化 几乎导致对临床上常用的所有氨 基糖苷类抗菌药物高水平耐药 年 我国台湾 地区就有两家医院出现 和 基因阳性的大 肠埃希菌造成的医院感染 株对阿米卡星的 最小抑菌浓度 的大肠埃希菌中 株检测到 基因 株含 基因 在 为 菌株中 和 基因均为阴 性 本组实验中 株也检出 基因 且对庆大霉 素 妥布霉素和阿米卡星均耐药 提示含 甲基化酶基因的菌株对氨基糖苷类药物呈高度耐药 现象 尽管本次大肠埃希菌 甲基化酶基 因检出率只有 但该耐药基因可在菌株 间传播 应引起人们高度重视 另外 型基因不仅对氨基糖苷类药物有修饰作用 而且 对喹诺酮类药物也有修饰作用 引物由无锡市克隆遗传技术研究所糜祖 煌根据 年 月 日之前已在 登录的各种序列的保守区域完成 设计 并获授权使用 参 考 文 献 黄支密 单浩 糜祖煌 等 阴沟肠杆菌 甲基化酶基 因及氨基糖苷类修饰酶基因研究 中华流行病学杂志 黄支密 糜祖煌 储秋菊 等 鲍曼不动杆菌 甲基 化酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究 中华微生物学和免 疫学杂志 黄支密 糜祖煌 储秋菊 等 肺炎克雷伯菌临床分离株中出现 甲基化酶基因 中华流行病学杂志 糜祖煌 秦玲 泛耐药铜绿假单胞菌 甲基化酶 氨 基糖苷类修饰酶基因研究 中华医院感染学杂志 林宁 孙海平 糜祖煌 多重耐药大肠埃希菌 甲基 化酶 氨