高等植物的遗传转化1).pdf

遗传H E R E D I T A S B e i j i n g 1 1 4 3 9 4 2 1 9 8 9 综述 高等植物的遗传转化1 刘 春 明许 智 宏 山东师范大学 生物 系 济南 中国科学院上海植生所 自1 9 4 4 年A v e r y首次阐明肺炎双球菌的 遗传转 化机理后 人们 一直在探索适合高等植物的转化途 径 但 早期用D N A 直接处理种子 或细胞均未取得成功 1 9 7 年 V a n L a r e b e k e E s 等在根癌 农杆菌中发现一 种与双 子叶 植物肿瘤诱导有关 的质粒 即 T i 质粒 1 9 7 7 年C h i l t o n L 等用 限制性内切酶谱法证明 在植 物的冠廖瘤组织中存 在农杆菌T i 质粒的一个片段 称 为转移 D N A T D N A T D N A 在植物基因组中的 整合和表达导 致肿瘤的发生 此后以 T i 质粒为基础 的植物遗传转化研究获得迅速发展 在理论和应用方 面均取得很大成就 本文主姿对 植物转化的机理 和方法进行综述 一 农杆菌参与的植物遗传转化 迄今为 止应用于植物遗传转化的农杆菌主要有两 个种 根癌 农杆菌 A g r o b a c t e r i u m t u m e l o c i e n s 和发 根农杆菌 A r h i x o g e n e s 属根瘤菌科 具鞭毛 为杆 状草兰氏 阴性菌 根癌农杆菌感染双子叶植物时 可 在被感染的伤口 附近形成冠瘦瘤 C r o w n g a l l 冠m 瘤有两种形态 一是无组织的 肿瘤 在无激素培养基上 可无限生长但不分化 二是畸胎瘤 可分化形成畸形 芽 在无激素培养基上不断增殖 但无顶端优势且难以 生根 与冠瘦瘤诱导有关的 质粒为T i 质粒 发根农杆 菌感染植物时可使植物在感染部位产生众 多 的发 状 根 与此有关的是R i 质 粒L 3 3 由于所用菌株不同 转 化细胞系可特异性地合成不同类型的氨基酸或塘的含 氮衍生物 称之为冠癣碱 O p i n e 现已发现的冠瘦 碱有十五种以上 包括章鱼碱 O c t o p i n e 胭脂碱 N o p a l i n e 和农 杆碱 A g r o p i n e 等 是农杆菌赖以 生存的碳源 和氮源 1 农杆菌 T D N 转移机理通 过 T i质 拉 将T D N A导 人 植物 基 因 组 从 而转 化 植物细胞是自 然界存在的一种天然遗传工程 T D N A 携带真核生 物基因的表达调节信号 可依赖植物细胞的 R N A 聚 合酶 II 进行 p o l y A R N A 转录 在转化的冠痪瘤组 织中 T D N 编码的转录子有 7 9 个 基因 1 和基 因2 编码生长素叫噪乙酸合成途径的两个酶 基因 4 编码与细胞分裂素合成有关的异戊烯基转移酶 这三 个基因协同作用的结果决定肿瘤特征及在无激素培养 基上生长的能力L r 2 s 基因 3 编码与章鱼碱和胭脂碱 合成 有关的酶 不同 类型的根癌农杆菌T D N A的 大 小不同 胭脂碱型农杆菌的 T D N A为 一连续片段 约 2 3 2 4 k b 章鱼碱型农杆菌的 T D NA 为靠 近但不 连续的两部分 长度 分别为 1 3 k 6和 8 k b左右 T D N 人编码的所有酶均同转移过程无关 影响基因 转移 的顺序主要有以下几个 1 边界序列 T D N A的两 端边界处各 有一个 2 5 b p 的正向重复边界序列 该序列是唯一以顺式影响 T p N A转移的序列 右边界要比左边界 活跃得多 对于一个缺失右边界附近3 k 6 D N A的非致病突变 体 插入一个 2 5 b p 的 边界序列就足以恢复其转化活 性 而 且其作用是有方向性的 如将边界序列的方向颠 倒 转化活性则明显降低 此外 在左边界和右边 界的右侧 还各有一个转化驱动子 o v e r d r i v e 也是 T D N A高效 率转 移 不 可 缺 少的 2 V i r 区 位于 T i质粒 T D N A区的左侧 长 度为一 3 5 k 6 左右a 虽然该区基因与维持肿瘤性状无关 也不整合到植物染色体上 却是 T D N A转移过程必 不可少的 已经鉴定出来的 V i r区位点有六个 分肘 为 V i r A V i r B V i r C V i r D V i r V i r G 每个位 点为一个独立的操纵子 但有的有多个读码框 V i r A 为组成型表达 V i r B V i r C V i r D V i r 的表达受 植物细胞释放的一些小分子水溶性 化合物 的诱 导 V i r G具较高水平的基础表达 F o u n d a t i o n a l e x p r e s s i o n 同 时 也受 植 物的 诱导 现已 发 现同 激 活V i r 区基因表达有关的信号分子有九种 均为酚类化合物 乙酞丁香酮和经基乙酞丁香酮作用较强 用儿茶酚 原 L i u C h u n m i n g et a l Ce n e t i c Tr a n s f o r ma t i o n o 6 Hi g h e r P l a n t s 1 本文承姚敦义教授审阅指正 特此致谢 本文于 1 9 8 年 8月 2 0日收到 儿茶酚 没食子酸 焦性没食子酸 经基苯甲酸 香草 酚和对经基苯酚这七种化合物同时处理农杆菌时 也 可使 V i r 区所有基因表达 单独使用时效果则差得 多 V i r 和 V i r G的 产 物 为 调节 蛋白 前者 存 在于细胞膜内 可以感受胞外植物信号分子的存在 启 动 V i r 区 其它基因的表达 V i r D编码一种核酸内 切 酶 可以识别 T D N A的边界序列 特异性地在 2 5 b p 处剪切形成游离的 T D N A转移中间物 V i r C可识 别转化驱动子序列 同 T D N A 的转移效率有关 其 它三个区的功能尚不十分清楚t l 33 O 3 染色体致病区 c h v 该区由农杆菌的细胞 核染色体编码 长度为 I l k 叭与农杆菌同 植物细胞间 的附着有关 编码合成2 一 环状 R D 葡聚糖有关的酶 c h v突变也会使转移功能丧失 对于 T D N A的 转移方式有两种不 同的观 点 M s c h i d s t 3 等人认为T D N A 是以双链环状形式转 移 他们在转化过程中分离到 T D N A的环状中间体 这种环状 分子是T D N 人在左右边界处闭合而成 只 在农 杆菌与 植物细胞相互 作用时才发现 S t s c h e l t 1 等 人提出 T D N A是以 单链线状形式转移 因为这种 形式的 T D N A占游离 T D N A 的7 0 11 o 以上 他们 认为有一种蛋白质同 T D N 人 的右边界共价结合 引 导 T D N 的转移 N e s t e r教授学术报告 从目 前 研究结果看 后一种 观点 比较合理 也容易解释右边界 的特殊性 农杆菌向植物细胞转移 T D N A的过程 可能与细菌质粒的 接合转移十分相似 由 于 T i 质粒很大 2 0 0 k b 提 取困 难 限制性 内切酶酶谱复杂 难以直接进行遗传操作 故一般是利 用中 间载体在 中 进行基因重组 常用的 T i 质粒载 体重组系统有三种 共整合载 体系统 末端拼 接载体系统和双质粒载体系统 对此已 有文章评述 构建后的嵌合基因通常包括植物细胞可识别的启动子 和终止 信号 需导人的 外源基因及筛选转化体必需的 标记基因 肿 瘤基因可以作为选择标记 但得到的转 化细胞难以再生为 完整植株 故一般用 P B R 3 2 2质拉 将与肿瘤形成有关的基因替换下来 使用最广泛的植 物细胞选择标 记基因 是来自 转座子 T n 5的新霉素磷 酸转移酶基因 N P T 1 1 该基因的表达可使植物细 胞对 氨基葡萄糖昔类抗菌 素 如新雄素 卡那霉素 G 4 1 8 等产生抗性 利用嵌合的 NP T I I基因已成功地 得到 了烟草 番茄 矮牵牛 马铃薯 大豆 首猎 小麦 水稻 玉米 黑麦草等二十多种植物的抗性细胞系或植 株 此外 氯霉素乙酞转移 酶 C A T 潮 雄素 B 磷酸 转移酶 荧火虫的荧光素酶 9 葡萄糖普酸酶 G U 勺 也是重要的标记基因 G U S 的优点是能够用荧光分光 光度 计对基因表达的水平进行定量测定t 7 6 3 O T D N A 的携带能力很强 被转移的外源 D N A片 段可长达5 o k b 但由 于植物细胞不能识别外源基因的 转录调节信 号 早期嵌人 T D N A中的基因虽可整合 到 植物基因组中却未能表达 1 9 8 3 年的下半年 H e r r e r a E s t r e l l a t 3 3 B e v a n t 和 F r a l e y t 三个研究小 组同时将胭脂碱合成酶基因的启动子 N O S 和 N P T 1 1 基因的编码序列拼接 利用 T i 质粒作载体转移到烟 草中 并得到 了表达 这 一开创性工作为植物基因工程 的发展和基因调控的研究开辟了广阔的道路 到目前 为止 利用二十多种不同来源的启动子 已使多种外源 基因在植物细胞内得到了表达 表 1 2 0 2 利用农杆菌 转化植物细胞的方法根癌农杆 菌 的活 主 范 围 很 广 据D e C l e e n e t 等1 9 7 6 年的统 计资料 至少有 3 3 1 属的 6 4 3 种植物可被农杆菌感染 致瘤 最近的一些研究结果表明 T D N A可以转移 到单子叶植物细胞内并表达 川 目前常用的农杆菌 转化方法有三种 0 整株感染 用 对数生长期的农杆菌对植物的 创伤 部位进行感染 然后无菌培养肿瘤组织 这是最简 便的转化方法 其优点 是实验周期 短 但肿瘤组织中 常混有未转化的正 常细胞 即 形成 嵌合体 无肿瘤基 因的农杆菌进行整株感染较难 但 可将感染部位的薄 层组织切下后在选择培养基培养 以筛选转化体 在 1 植 若因工性中常用的启动子 类别来源基因 T DN人NOS 组 成 型 表 达 OCS 组 成 型 表 达 MA S T r DN A 组成型表达 t ml 组 成 型 表 达 5 号基因组织特异性表达组 双向启动子成型 可双向控制 两个基因的表达 病毒C a MV 基因 V I 组成型表达 C a MV 3 5 S基因 组成型表达 活性强 细胞周期S特异表达 植物叶绿素 a b 结合蛋白 叶片中光诱导表达 R u B P梭化酶小亚基 叶片中光诱导襄达 查尔酮合成酶光诱导表达 大豆血红蛋白根瘤中特异表达 玉米醉溶蛋白 Z 胚乳特异性表达 玉米醉脱氮酶厌氧条件下表达 玉米热击蛋白高温时表达 大豆热击蛋白4 0 培养时表达 动物果姆热击蛋白热诱导性表达 2 叶圆片法 该方法是由 H o r s c h t z 3 3 等 人建 立 在烟草 番茄 矮牵牛和杨树等植物应用成功 其 步骤是用打孔器取得叶圆片 在过夜培养的农杆菌菌 液中 浸数秒 后 置于培养基上共 培养2 3 天 再转移 裹 2 在植物细饱内表达的外派苍因 布 XI HTF3 f JlX fX1 f W Nt d xm Nt n Nt Nt Jnn 9 ENt ntNt pT tt i JNt pJi I Nt g VL TMVNt t AMV Nt E31A RNANt 71 f H Nt VL AIMV GNt n3 一 说明 Nt 普通烟草 C 转化细胞系 P 转化植株 到含抗菌素的选择性培养基上 使转化细胞直接再生 为 植株 我们曾用 胶烟草 N i c o ti a n a g l u ta n o t a 的悬 浮培养细胞制成的滋养板对农杆菌处理过的叶圆片 进 行看护培养 使普通烟草的转化效率提高了 3 倍左右 推测可能是滋养细胞补充 了叶圆片所释放的信号分 子 的不足 未发表 改良 的叶圆片法可以用于茎段 叶 柄甚至萌发种子 1 的转化 最容易再生的组织作外 植体最佳 3 共 培养法 将处在再生壁时期的原生质体与 农杆菌 一起共 培养3 6 小时 离心去菌后在选择培 养基上培养便可得到转化的细胞系 这一方法与传统 的伤口 感染比较 得到的转化体一般不会有嵌合现象 故在应用方面具重要价值 用该方法转化成功的植物 有烟草 矮牵 牛 向日 葵 胡萝卜 胶烟草t 3 1 龙葵等 在 共培养过程中 新形成的初生壁和某些二价阳离子 不 是 C a 为农杆菌的附着和转化所必需 卫志明等 的工作表明 共培养法同样可用于发根农杆菌 R i 质粒 T D N 的转 移 3 7 3 O 二 D N A 直 接 转 化 显然 农杆菌的 T i 质粒是植物遗传工程的有效载 体系统 但是由于宿主范围的局限性 对于 占农作物 主要部分的 禾谷类难以被农杆菌转化 为 解决这一难 题 发展了 D N A直接导 入技术 即 用裸露的 D N A 经特殊的处理转移到植物原生质休中 包括以下两种 方法 I 原生质体对外源基因的直接摄人在某些多 聚化合物 如 P E G P V A 聚一 一 鸟氨酸存在时 把植 物原生质体与质粒 D N A 一起培养 原生质体可摄入 外源基因而被转化 高压电脉冲可使细胞质膜形成可 逆性通道 大大提高原生质体的转化效率 这一方法 称为电穿孔法 e l e c t r o p o r a t i o n 最近 S h i l l i t o t 3 等 通过选择最适脉冲强度 P E G浓度和快速热处理等对 D N A直接转化方法进行了若干改进 使转化效率提高 了1 0 0 0 倍 在非选择培养基上 再生的克 隆有2 被转 化 向植物原生质体传递的 D N A有三种形式 1 D N A 纯品 包括 T i 质粒 E c o l i 质粒等 2 磷酸钙一 D N A 一 共沉淀物 3 脂质体包括的 D N A 利用这一方法已得到小麦 水稻 玉米 黑麦草等 禾本科植物的转化体 1 2 微注射法 Mi c r o i n j e c t i o n 将外源基因直 接注射到原生质体中有明显几个优点 1 转化效率 可高达1 0 2 转化体不需要特殊的选择系统 这 在应用方面尤为重要 3 可以克服农杆菌宿主范围 的局 限性 当 然这一方法需以精细的显微操作技术 私 原生质体低密度培养为基础 1 三 外源甚因在植物细胞中的命运 无论是农杆菌参与的转化还是 D N A 直接 转化 都可使外源基因整合到植物细胞核基因组并遗传给后 代 呈典型的孟德尔遗传 有实 验表明 T D N A也可 以整合到叶绿体基因组而表现为母系遗传工 外源基 因 在植物基因组中似乎没有专一性插入位点 每个单 倍体基因组中 一般可整合1 5 个T D N A A m b r o s D 等用 原位杂交的 方法证明 发根农杆菌的 T D N A在 41 献 参考 1 2 罗 士韦 许智宏等 1 9 8 2 1 6 文献 细胞生物学杂 志 4 4 1 Jl JJ JleeJIJ 此j乙 哎夕61了 r Lr L户几Lr L工 L 891011121314巧16171819202122 还阳参的每一条染色体上都可能整合 转化方 法不 伺 转化细胞中 T D N A的结构 也不同 农杆菌参与 转化的细胞 T D N A比较规则 多在 2 5 b P 处与植物 D N A连接 少数情况下也会出现T D N A的串 联和截 短现象 T D N A的串联是以反向重复形式为主 截短可能 是因为 T D N A两侧还各有一个2 5 b P 边界 的类似序列 3 6 3 用裸露的 D N A直接转化时 T D N A 往往出现很复杂的杂交图谱 包括环化 甲基化 片段 分离和丢失等 虽然多 T D N A转化现象很 普遍 但奇怪的是多数情况下呈单因子遗传 即自交后代呈 3 1 分离 原位杂交结果表明 这些 T D NA是以集团 形式连锁存在的 J 二J J 之曰月 气 曰 白 LF 护 四 植物遗传转化的应用前景和局限性 植物基因重组和遗传转化虽起步较晚 但发展迅 速 在应用领域最突出的成就是在抗性方面 包括抗 病毒病 真菌病 抗虫和抗除草剂等 据 A b e l t 6 l等报 道 将 C a MV的 3 5 S 启动子与 T M V外壳蛋白基因的 编码序列连接 后转移到烟草细胞内 使转化 植株在病 毒感染后的发病时间明显延迟 使植物在生长期免遭 病害 其原理类似于交叉保护作用 在抗虫方面 由于 苏云金氏杆菌 B a c r i l u s th u r s n g tc n s s 的伴抱晶体蛋 白对鳞翅目等昆虫的幼虫有毒杀作用而对人体 无 害 比利时和美国的科学家已将该基因通过 T i质粒导人 植物细胞 并得到抗虫植株 目前已获美国农业部批 准进行大田试验 在抗除草剂方面现多集中于 E P S P 合 成酶和谷耽甘肤 S 一 转移酶基因的分离克隆 已分别得 到抗草甘麟和阿 特拉津的植物 13 2 0 1 0 贮藏蛋白的基 因工程进展也较快 不少研究者感兴趣的是如何提高 农作物贮藏蛋白中必 需氨基酸水平 J a y h e s t 等人 合成了一段富含各种必需氨基酸的基因序列 通过 T i 或 R i 质粒转移到马铃薯中 并得到了表达 光合作用 也是基因工程研究的重要方面 R u B P 1 5 一 二磷 酸 核酮糖梭化酶 基因是目前研究最多的植物基因之一 其小亚基基因的克隆及转化方面已有很多工作 不少 人期望通过基因工程手段提高该酶的含量 及 C O 固 定效率 从而改善光合效应 3 0 3 0 现在高等植物的基因工程主要集中于单基因控制 的质量性状 而对产量有关的 多基因数量性状则无能 为力 无疑 在相当长的时期内 常规杂交仍是育种的 主要手段 目 前在高等植物的 遗传操作方面我们面临 的困难还很多 如可供利用的目的基因不多 对高等植 物的遗传背景了解很少 许多经济作物 特别是禾谷类 和豆科植物的原生质体培养仍有不少困难等等 但是 植物遗传转化毕竟为 我们提供了 一套向植物导人外源 基因的方法 随着对植物基因结构和调控机理的深入 研究 基因 工程一定会 在作物品质改良 上作出重要贡 2 6 刘春明 许智宏 1 9 8 8 头鉴生物学报 2 1 3 2 7 3 2 8 3 0 白永延等 1 9 8 4 细胞生物学杂志 6 3 9 7 1 0 2 唐惕等 1 9 8 4 植物生理学通讯 8 4 4 1 7 o 朱群等 1 9 8 7 细胞乡 勺 学杂志 9 1 1 6 1 9 A b e l P P e t a l 1 9 8 6 S c i e n c e 2 3 2 7 3 8 7 4 3 A k i y o s h i D E e t a l 1 9 8 4 P A N S 8 1 5 9 9 4 5 9 9 8 Amb r o s P F e t a l 1 9 8 6 T h e E MB O J 5 2 0 7 3 2 0 7 7 B e v a n M W e t a l 1 9 8 3 Na t u r e 3 0 4 1 8 4 1 8 7 B h a t i a C R e t a l 1 9 8 6 P r o c I n d i a n Ac a d S c i P l a n t S c i 9 6 7 9 1 1 2 B o l t o n G W e t a l 1 9 8 6 S c i e n c e 2 3 2 9 8 3 9 8 5 C h i l t o n M D e t a l 1 9 7 7 C e l l 1 1 2 6 3 2 7 0 C i b a g e i g y 1 9 8 6 B i o T e c h n o l o g y 4 1 0 4 7 C o c k i n g E C e t a l 1 9 8 7 S c i e n c e 2 3 6 1 2 2 9 1 2 3 1 C r o s s w a y A e t a l 1 9 8 6 MGG 2 0 2 1 7 9 1 8 5 C z e r n i l o f s k y A P e t a l 1 9 8 6 D NA 5 1 0 1 1 0 3 C l e e n e M D e D e L e y J 1 9 7 6 B o t R e v 4 1 3 8 9 4 6 6 C l e e n e M De e t a l 1 9 8 5 T h e E MB O J 5 2 0 7 3 2 0 7 7 F e l d ma n n K A e t a l 1 9 8 7 MG G 2 0 8 1 9 F i l l a t t i J J e t a l 1 9 8 7 MG G 2 0 7 2 0 4 2 0 9 F r a l e y R T e t a l 1 9 8 3 P NA S 8 0 4 0 8 3 4 0 8 7 H e r r e r a E s t r e l l a L e t a l 1 9 8 3 Na t u r e 3 0 3 2 0 9 2 1 3 Ho r s c h R B e t a l 1 9 8 5 S c i e n c e 2 2 7 1 2 2 9 1 2 3 1 I n z e D e t a l 1 9 8 4 MG G 1 9 4 2 6 5 2 7 4 J a y h e s J M