[理学]第四章 DNA复制.ppt

第四章DNA复制 遗传信息的传递与保持 遗传信息的传递 中心法则 遗传物质在细胞周期中通过复制产生子代DNA 经细胞分裂而传递给子代细胞 或者经包装产生子代个体 从而将遗传信息传递给子代细胞或个体 2 Semi discontinuousreplication 半不连续复制 1 Semi conservativereplication 半保留复制 1 DNA复制的两个基本特征 一 DNA的复制内容 第一节DNA复制 Replicons 复制子 origins andterminiSemi conservative 半保留 mechanismSemi discontinuousreplication 半不连续复制 RNApriming RNA引导 注意理解如下内容 LaggingstrandofDNAmustgrowoverallinthe3 5 directionandissynthesizeddiscontinuouslyintheformofshortfragments 5 3 thatarelaterconnectedcovalently LeadingstrandofDNAissynthesizedcontinuouslyinthe5 3 direction Okazakifragmentsaretheshortstretchesof1000 2000basesproducedduringdiscontinuousreplication theyarelaterjoinedintoacovalentlyintactstrandPrimerisashortsequence oftenofRNA thatispairedwithonestrandofDNAandprovidesafree3 OHendatwhichaDNApolymerasestartssynthesisofadeoxyribonucleotidechain 1 DNA解链酶 helicase 是通过水解ATP获得能量来解开双链DNA的一类酶的总称 其中有的参与DNA的复制 有的参与DNA的重组 修复等非复制过程 2 单链结合蛋白 single strandbindingprotein SSB 诸如真核生物中的复制因子A RF A 这类蛋白质 与DNA单链相结合 既防止核酸酶的水解又避免DNA单链重新构成双链 还可使其前端的双螺旋的稳定性降低 易于双链的解开 原核生物SSB结合表现为协同效应 如第一个SSB结合能力为1 则第二个结合力可高达103 而真核生物的SSB无此效应 3 拓扑异构酶 topoisomerase 前已述及 其中I型的有大肠杆菌的拓扑异构酶I III 真核生物的DNA拓扑异构酶I II型的有大肠杆菌的拓扑异构酶IV 噬菌体 T4 真核生物的DNA拓扑异构酶II 2 参与DNA复制的酶和相关蛋白 4 DNA聚合酶是以DNA单链为模板 以dNTP为底物 合成子代DNA链的酶 在DNA复制和修复中起作用 须Mg2 激活 并存在提供3 OH末端的引物链 5 引物酶 primase 以DNA单链为模板 以NTP为底物合成寡核苷酸引物的酶 是DNA指导的RNA聚合酶 为什么需要RNA做引物而不直接起始一条DNA链 6 DNA连接酶 ligase 是封闭新合成链上去除引物并由DNA聚合酶I填补缺口后留下的缺口 催化DNA复制的最后步骤 有几种方法为DNA聚合酶提供3 OH端 从而起始DNA的合成 A 由RNA引物起始 B 由切口起始 C 由蛋白结合DNA末端的单核苷酸起始 3 复制的基本过程 1 引物合成是DNA合成起始所必需的 2 DNA合成是在3 OH末端添加dNTP DNA RNA 5 to3 Protein NtoC 3 5 phosphodiesterbond3 5 磷酸二脂键 PPi pyrophosphate SubstratesforDNAsynthesis deoxynucleoside5 triphosphates三磷酸脱氧核苷dNTPs dATP dGTP dCTP TTP Sanger的酶学测序原理就是根据DNA复制提前终止来确定的 3 复制的基本单元 复制子 Replicon 及复制方向 Repliconsmaybeunidirectional 单向的 orbidirectional 双向的 Bidirectionalreplication 双向复制 ofacircularbacterialreplicon Origin Terminus DaughterDNA structure 几乎所有的原核生物染色体 许多噬菌体和病毒DNA分子都是环状的并且都由单一复制子组成 singlereplicons 线性病毒DNA分子只有一个复制起点真核生物的染色体 多复制子 Multiplereplicons 每个复制子有其自身的复制起点 哺乳动物细胞在50 200kb长的DNA上约有5 10万个复制子 Multipleeukaryoticreplicons Replicationfork Multipleeukaryoticreplicons 4 怎样鉴定半保留复制 MeselsonandStahl 1958 Heavyisotope15N normal14NEquilibrium isopycnic densitygradientcentrifugation BacterialDNA Semi conservativemechanism 15Nlabelingexperiment 5 半不连续复制 Semi discontinuousreplication 冈崎片段Okazakifragment 3H Thymidinepulse chaselabelingandalkalinesucrosegradient discoveryofsemi discontinousreplication DNAligase nascent 1000 2000nt prok and100 200nt euk Semi discontinuousreplication Okazakifragment 复制小体 Replisome 用于DNA合成时存在于复制叉上的多蛋白复合结构 包括DNA聚合酶和引物酶及其他酶类 Replisome 6 环状DNA的复制 型 滚环型 D 环型 MinimalseqofOriC DnaA DnaB C 二 BacterialDNA复制 1 复制起始 蛋白顺序结合于复制起始区用于引物合成 Initiation DnaA 解旋 是在topoisomeraseII或称为DNA旋转酶的作用下 解开螺旋产生DNA部分单链的过程 Gyrase是抗生素作用的靶位点 例如新生霉素是细菌复制的有效抑制剂 细菌生命周期快的因素之一是有些细菌在单次复制尚未完成时就在新的复制起始区重新启动复制 Ter terminus O origin Tersite a oriC包含四个9bp的与起始蛋白DnaA结合的位点 DnaA的合成与增长速率相关 因此复制的起始也与增长速率相关 b DnaA由30 40个分子构成复合物 其利于三个13bpAT rich重复序列的解链 从而有利于DnaB的结合 c DnaB利用ATP水解释放的能量使DNA双链解开的解链酶 d SSB single strandedbindingprotein 结合在解开链的DNA上 ssDNAbubble e DNA引物酶 装载用于合成前导链中的短RNA引物 f 引发体 DnaB解链酶和DNA引物酶构成的复合体 进行DNA复制的起始 参与复制的起始主要结构 2 延伸 Elongation a DNApolymeraseIIIholoenzyme 全酶 二聚体复合物 一半合成前导链 一半合成后随链 b 确保双链以相同的速率进行合成 c 每个单体都含有一个a subunit 亚单位 行使酶的功能 e subunit 3 5 proofreading 校正 exonuclease 核酸外切酶 b subunit clamp 夹住 聚合酶与DNA不同物种中其他的亚单位各不相同 d RNA引物的去除及DNApolI填补空缺e 冈崎片段是通过DNA连接酶来连接的 DNApolIII二聚体同时合成前导链和后随链 E colipolymeraseIII全酶 Betaclamp 夹 andOkazakifragmentinitiation SynthesisofOkazakifragmentsrequirespriming extension removalofRNA gapfilling andnickligation Nicktranslation E coliDNApolymeraseI可以在DNA双链降解的单链缺口处合成新物质而填补缺口 从而产生使缺口向后移动的效果 可以用来在体外介导带有标记性的脱氧核糖核苷酸进入DNA 产生标记探针 Nicktranslation缺口平移 DNAPolI singlepolypeptideof103kD Trypsin 胰岛素 cleavge 68kDlargefragment Klenow with5 3 poland3 5 exonucleaseactivity smallfagment 35kD with5 3 nucleaseactivity 3 终止和分离 终止区大约在oriC复制起点相对的180 位置上 TopoisomeraseIV解开连环状的子代基因组 ter directional 细菌DNA分别粘附到膜上从而能够分离 通过OriC的甲基化来控制每个细胞周期只进行一次DNA复制 11copiesinOriC G1preparingforDNAreplication cellgrowth SDNAreplicationG2ashortgapbeforemitosisMmitosisandcelldivision Cellcycle EntryintotheS phase CyclinsCyclin dependentproteinkinases CDKs signaling 三 真核生物DNA的复制 1 复制起始 Initiation a 在整个S phase 大约有20 50replicons 复制子 构成簇状同时起始 EarlyS phase euchromatin 常染色质 replicationLateS phase heterochromatin 异染色质 replicationCentromeric 中心粒的 andtelomeric 端粒的 DNAreplicateatlast b 每个复制子的复制起始区域可以发生在随机的部位c 自动复制序列 Individualyeastreplicationorigins ARS 克隆到质粒中 可以使质粒在酵母中 aeukaryote 复制 ARSs 含有酵母复制起始位点的自主复制序列 Minimalsequence 11bp A T TTTAT A G TTT A T TATAbox 复制起始识别复合体 originrecognitioncomplex ORC bindstoARS 通过CDKs的活化 ORC启动theDNA进行复制 Licensingfactor准许因子 Initiation Onlyonceinonecellcycle EukayoticrepliconscanonlyinitiateoncepercellcycleLicensingfactor Mcm在复制起始中需要 而随后灭活的因子在有丝分裂中只有核膜裂解后才能进入到核中 2 复制叉形成和延伸 DNA从核小体上解旋的速度为50bp sec 需要解旋酶和复制蛋白A RP A 的存在 由引物酶和行使聚合酶功能的DNA聚合酶 起始两链的合成 DNApolymerase 和 分别进行前导链和后随链的延伸 Elongation 三种不同的DNA聚合酶参与1 DNApol 具有引物酶活性可合成前导链和每个后随链中的RNA引物 随着DNA的延伸迅速被另两种酶所取代 2 DNApol 在前导链上取代DNA聚合 能合成长的DNA replicase PCNA proliferatingcellnuclearantigen 类似于大肠杆菌聚合酶III中的 subunit 3 DNApol 在后随链上取代DNApol 合成短的Okazakifragments 135bpinSV40 其他DNApolymerases forDNArepair formtDNAreplication 新的核小体在复制叉经过后由新旧混合组蛋白聚集于DNA形成 3 核基质 核骨架 nucleiscaffold 是由不溶性蛋白质纤维构成的 用于DNA复制 转录等核加工过程的组织框架 是复制的工厂 所有DNA复制酶及相关的复制叉均在此处显示 利用5 尿嘧啶抗体荧光染色所观察的结果 组织进核骨架中的复制叉 Propidiumiodidestaining BUdRAbstaining 100 300foci CelllabeledwithBUdR Howarethevery5 endscopied 真核生物中端粒长度是可变的连接成环状或多聚体形式 e g T4andlamda草履虫中线性的线粒体DNA交叉成十字样的特殊结构象腺病毒那样利用蛋白起始 Eukaryotictelomeres 端粒 染色体末端多拷贝简单重复序列 3 端长于5 端 Telomerase 端粒酶 含有短RNA 部分互补的重复序列 与细胞衰老和癌症相关 Humantelomere 5 TTAGGGTTAGGG TTAGGG nTTAGGG 3 3 AATCCCAATCCC 5 Repeatsequence Tetrahymena TTGGGG human TTAGGG telomerase Telomerereplication solvingtheproblemoflaggingstrandsynthesis AdenovirusDNAreplicationinitiation 四 DNA聚合酶控制DNA忠实复制 DNA聚合酶在合成DNA时所具有的3 5 外切酶活性 可以起到修正错误的功能 细菌中实际复制错误发生率为 10 8 10 10 相当于每个细菌基因组在每1000个复制周期中发生1次错误 或每代每个基因有 10 6几率发生错误 Similarfunctionsofprokaryotic eukaryoticandphagerepilcationapparatus 五 原核和真核生物DNA复制比较 Sizeofreplicons ProkaryoticDNA 1000kbYeastorflyca 40kbMammalsca 100kbOkazakifragments ProkaryoticDNA 1000 2000ntEukaryoticDNA 100 200ntRateofreplication ProkaryoticDNA 50 000bp min 900 sec EukaryoticDNA ca 3 000bp min 50 sec 原核细胞和真核细胞中的DNA复制 1 Semi conservativereplication2 Semi discontinuousrepliction3 DNAhelicase Ssb4 RNApriming5 Proofreading Origin single multiple 2 Initiation multiple onetimes licensingfactor3 Rateofreplicationforkmovement 900 50nt S 4 SizeofOkazakifragments5 Telomeresandtelomerases6 Polymerases simple complex Similarities Differences 判断1 原核生物DNA复制是连续的 而真核生物DNA的复制是半保留和半不连续 2 DNA复制的半不连续模型是由复制时两条DNA单链分别复制得来的 3 原核生物DNA聚合酶I是DNA合成中最主要的酶 4 所有生物DNA的复制都要有准许因子的存在方能进行 5 原核生物DNA的复制要有准许因子的存在方能进行 6 真核生物能否进行DNA的复制是通过甲基化来控制的 第二节遗传信息的保持 遗传信息 DNA 在受外界理化因素的影响 紫外线或射线照射 化学诱变剂 或在复制过程中 都有可能发生碱基的改变 从而造成突变 沉默突变 无义突变 错义突变 但在自然界中这种突变的发生率是较低的 主要是由于生物体具有一系列的反应机制来修复受损的DNA DNArepair DNA修复 主要有如下几种方式 1 光活化修复2 烷基转移酶修复3 切除修复4 错配修复5 易错修复6 重组修复 核苷酸切割修复 碱基切割修复 1 光活化修复 在光照下 光裂化酶解开嘧啶二聚体而达到直接修复作用 2 烷基转移酶修复 在烷基转移酶的作用下去除发生烷基化鸟嘌呤中的烷基而恢复为原有的鸟嘌呤 3 切除修复 核苷酸切除修复 核苷切除修复 4 错配修复 Mismatchrepair 复制后母本链中GATC的A迅速甲基化 而子链无甲基化 MutH MutS识别错配碱基和附近的GATC DNAhelicaseII SSB exonucleaseI去除包括错配部分的DNA片段 DNApolymeraseIII DNAligase填补空隙 由日常型甲基转移酶负责而从头合成型甲基化酶负责CpG岛的甲基化 速度慢 同源重组 位点特异性重组 转座重组 6 重组修复 5 易错修复在无模板的情况下 直接添加核苷酸而完成的修复 由于此修复无模板 因而极易产生差错 DNA重组修复 a 复制遇到DNA损伤部位 跳过损伤部位在损伤部位旁重新起始复制 c 以父本姊妹链为模板进行复制 进而填补子链空隙 d 继续复制填补剩余的受损部位 同源重组 发生在同源序列间的重组称为同源重组 homologousrecombination 又称基本重组 是最基本的DNA重组方式 通过链的断裂和再连接 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 以E coli的同源重组为例 了解同源重组机制的Holliday模型 主要包括4个步骤 两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂 并与另一个DNA对应的链连接 形成Holliday中间体 通过分支移动产生异源双链DNA Holliday中间体切开并修复 形成两个双链重组体DNA 分别为 片段重组体 patchrecombinant 拼接重组体 splicerecombinant 位点特异性重组 位点特异性重组发生在特殊序列对之间 这一重组型式最早是在 噬菌体的遗传学研究中发现的 噬菌体有两种存在型式 裂解状态和溶源状态 两种类型间的转换是通过位点特异性重组实现的 Oneantibodyexampleproducedbysite specificrecombination 免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白 Ig 由两条轻链 L链 和两条重链 H链 组成 分别由三个独立的基因族编码 其中两个编码轻链 和 一个编码重链 轻链的基因片段 重链的基因片段 重链 IgH 基因的V D J重排和轻链 IgL 基因的V J重排均发生在特异位点上 在V片段的下游 J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列 recombinationsignalsequence RSS 此重排的重组酶基因rag recombinationactivatinggene 共有两个 分别产生蛋白质RAG1和RAG2 V J 分子内转酯反应 单链切开转移核苷酸修复 连接 免疫球蛋白基因重排过程 转座子具有末端倒置重复序列 在DNA插入位点处产生正向重复 例如 靶位点重复5bpsequence 转座子末端反向重复9bp 数字1 9代表碱基排序 转座重组往往不能修复受损DNA 而会使遗传信息发生改变 A 定义及简史 转座因子或称可转位因子也称转座子 tansposableelementsortransposons 是生物体基因组内一类可以从一个座位转移到另一个座位的DNA序列 转座 transposition 转座因子的转移过程 研究简史生物基因组的不固定性 基因的大小 数目 位置 方向等 1951年BarbaroMcClintock首次在玉米中发现可转移的控制成分 随后又在果蝇中发现可转移的遗传成分 1967年在大肠杆菌中发现可转移的插入序列 此后 在细菌 酵母 果蝇 动物甚至人体等基因组内发现了各种各样的转座因子 1983年BarbaroMcClintock获诺贝尔奖 B 命名方法 标准命名 Transposons用Tn 数字 Tn1 Tn2 Tn3等 Insertionsequence用IS 数字 IS1 IS2 IS3等 转座因子插入特定基因时 galT135 Tn5非标准命名 真核生物转座子如玉米中Ac Ds系统 果蝇中Copia等 C 转座子的两个结构要素 序列 两端的RTR 20 40bp 决定转座的性质 酶 作用于靶序列及拆分位点 决定转座的频率 原核生物中的转座因子插入序列IS复合转座因子TnA转座子家族可转座的噬菌体Mu mutator D 分类 原核转座子 这是一类分子量较小的转座子 是最简单的转座子 组成特点 大多数IS长度在1 2kb之间 整个序列的大部分被转座酶基因占据 两端为12 25bp的短末端反向重复序列 转座后 在IS两侧基因组DNA上新的靶位点产生5 9bp的同向重复序列 插入序列IS 除了含有转座酶基因外 还携带其他标记基因 抗药性等 组成特点 由一个中心序列和位于两侧的臂组成 中心序列含有抗药性基因等遗传信息 左右两臂为两个相同或相近的IS序列 IS序列可以是同向也可以是反向 如Tn9为两个同向IS1 Tn1681为两个反向的IS1 有些复合转座子的两臂在结构上十分类似于目前已发现的插入序列 所以也称为类插入序列 如Tn10为反向重复的IS10L和IS10R Tn5为反向重复的IS50L和IS50R 由于每个IS序列都有自己的末端倒转重复 所以无论两臂的方向是同向或反向 整个复合转座子的最外端序列总是保持倒转重复 复合转座子的转座能力是由两臂的IS序列决定并调节 当两臂元件相同时 两者均可能起作用 当两臂组件不同时 往往依靠其中的一个起作用 如Tn5 IS50R Tn10 IS10R 原核转座子 复合转座子 与复合转座子家族相似 比较长 约有5kb 也同时携带负责自身转座的基因和抗药性基因 但结构仍有明显差别 两端没有IS或类IS组件 只有37 38bp的末端倒转重复序列 这类转座子包括Tn3 Tn1 Tn501等 组成特点 两端为37 38bp的末端倒转重复序列 中间一般有三个基因 同一转座子的两端序列十分接近 其中任何一个的缺失都会导致转座功能障碍 顺式功能 以Tn3为例 进行阐述 tnpA基因 编码转座酶 transposase 121aa 120Kda 功能是识别 高度特异性 并切割转座子的两端以及在靶位点产生5bp的参差不齐的单链末端 负责形成共整合体 TnpR基因 编码拆分酶 resolvase 185aa 23Kda 功能有两个 一是拆分酶活性 负责解开共整合体 二是阻遏蛋白活性 负调控tnpA基因及自身基因的转录 amp基因 编码 内酰胺酶 使氨苄青霉素失活 TnA家族转座子转座后 产生5bp靶位点同向重复 TnA转座子家族 Tra Amp TnpR res IS Tn TnA 真核生物中的转座因子 1 转座子 2 返座子 1 病毒大家族 逆转录病毒 全部 反转录转座子 2 非病毒大家族 非自主 自主 1 转座子 结构和转座机制与细菌转座子相似 遗传信息的流向是从DNA DNA 如玉米的Ac Ds因子 果蝇的P和FB因子等 但在酵母中不存在此类转座子 玉米转座成分Ac Ds系统Ac activator 自主成分 4 5kb 11bp的RTR 具备使自身切除或转座的能力 Ds dissociation 非自主成分 0 4 4kb 只有在与一组自主成分存在时才能切除或转座的成分 Ac Ds的转座机制尚不十分清楚 但它们的转座常伴随着在给点位置上的消失 只留下6 8bp的同向重复序列 与细菌转座有差别 P因子是真核生物中了解最清楚 应用最广泛 长3kb 31bp的ITR 8bp的靶位点GGCCAGAC 2 3的P因子有缺陷 无功能 果蝇转座成分P因子 1951年Maclintock玉米Ds Ac控制系统 2 返座子 转座机制与反转录病毒相似 遗传信息的流向从DNA到RNA再到DNA 转移过程称返座 retroposition 1 病毒大家族 逆转录病毒 全部 反转录转座子 如酵母的Ty 果蝇的Copia 玉米的BSI等 2 非病毒大家族 非自主 自主 1 病毒大家族 逆转录病毒 1 病毒大家族 反转录转座子 1 病毒大家族 反转录转座子 均起源于RNA聚合酶II和RNA聚合酶III的转录产物 大多数都与成熟的RNA序列相当 除了四种rRNA没有相应的返座子外 几乎每一类RNA都有返座子 非病毒转座子没有共同的结构特征 长度从33bp一直到6kb以上 一般没有转座酶的编码区 因此返座过程可能是被动的 返座以后产生7 12bp的靶序列重复 由返座而产生的假基因称为返座假基因 retropseudogene RNA聚合酶II合成mRNA snRNA 没有内含子 却有polyARNA聚合酶III合成tRNA 5srRNA Alu序列 一种短散在元件 SINE 长散在元件 LINE 为RNA聚合酶II转录产物的返座子 长6 7kb 编码反转录酶 有polyA 缺少LTR 仍可能发生返座 2 非病毒大家族 a 非自主 b 自主 转座的本质是转座子从一个位点转移到另一个新的位点 但在原来位置仍留一份拷贝 转座子与靶序列之间并没有同源性 转座过程也不依赖细菌的RecA蛋白质 转座发生后 受体DNA有一段很短的靶序列会进行复制 5 12bp 转座子就被夹在两个重复的靶序列之间 不同的转座子 靶序列的长度不同 同一转座子所有靶序列的长度一致 但序列不一定相同 两个顺向重复的靶序列对后续转座没有意义 转座的本质 插入位点靶序列的复制 E 转座特性 有的转座子有特异性整合 体现了位置优先性 但更多的是几乎随机整合 大多数的转座子有顺式免疫作用 cis immunity 避免整合至已存在相同类型的转座子的位点 转座子之间的距离有的很短 有时仅1 10kb 细菌复制型转座子优先转到质粒上 而不是由质粒转移到染色体上 靶位点的优先性 F 转座机制 转座分保守转座 非复制转座 简单转座 切割粘贴机制 和复制转座 非保守转座 复合转座 保守转座 从一个位点切下转座子而在另一位点整合 复制转座 转座子转座过程发生复制 一份留在供体位点 另一份整合至靶位点 返座机制 逆转录病毒转座和反转录转座子转座 转座子是一类自私DNA 成功的转座子经常发生转移 并尽可能地增加它的拷贝数 但不受控制的转座会破坏宿主基因组 并最终影响到转座子本身 所以大多数转座子在 1 转座频率 2 靶位点的选择和特定的细胞周期等方面进行调控 因此 转座总能在无限的扩展能力以及避免给宿主带来致命的损伤之间找到一个平衡点 G 转座调节 反义核酸的抑制 甲基化作用阻遏蛋白 顺式作用细胞周期 转座调控的方式 反义核酸的抑制 转座调节 Pout的活性比Pin强得多 并且两者间有一40bp的重迭 前者所产生的大量反向RNA能有效的抑制后者所产生的mRNA的翻译 甲基化作用 宿主的甲基化缺陷使Tn10转座酶容易起始转录 同时有利于转座酶与IS10R的结合 有利于