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Wnt蛋白检测原理 一 概述 1 WNT是一类广泛存在的分泌型糖蛋白 在动物的生长发育过程中 对细胞的增殖 分化和迁移起巨大的调节作用 决定细胞的极性 命运 前体细胞的增殖 体轴的建立 以及细胞的不对称分裂等 在成人以后 则主要参与机体内平衡稳定 目前已知的主要有19种WNT蛋白 其中激活经典通路的有WNT 1 WNT 3a和WNT 8 2 在胚胎发育过程和中枢神经系统形成中wnt信号通路具有重要的作用 调节着细胞生长 迁移以及分化 当体内的wnt通路失活会导致一些肿瘤癌症的发生 如果加入外源性的wnt蛋白可以激活wnt信号通路 我们使用的是果蝇的的S2 果蝇胚胎细胞 细胞 可以通过培养获得分泌的WNT3a蛋白 因此需要检测wnt蛋白的活性 一 检测用细胞LS L细胞 LS L细胞是小鼠的成纤维细胞这种细胞里已经转入了TOPFlash质粒载体 TOPFlashreporter最早是由HansClevers实验室构建 上面包括转录因子TCF LEF的结合位点 这个位点控制着荧光素酶报告基因的表达 但受 catenin转录活性调控 1 luciferase LS L细胞质中游离大量的 catenin蛋白 易与细胞内的降解复合体形成复合物 被蛋白酶泛化 最后被降解 存在Wnt蛋白时 降解复合体活性受到抑制 不与 catenin结合 catenin不被降解 稳定后的 catenin将进入细胞核 特异性地活化转录因子TCF LEF 激活Wnt信号下游特异靶基因的表达 也就是荧光素酶的表达 所以荧光素酶的表达量跟wnt蛋白的量称正比 TOPFLASH BufferA B Galacton plus 作为luciferase的底物 发生下列生物荧光反应 产生有颜色的物质 通过荧光扫描 读出OD值A 2 galactosidase LS L细胞中除了转入了TOPFlash质粒载体 还转入了LacZ基因 该基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因 能够翻译表达出 galactosidase AcCeLerator 试剂作为 galactosidase的底物发生反应 产生有颜色的物质 通过荧光扫描 读出OD值B所以 galactosidase的含量跟LS L的数量成正比 理论上每个孔的LS L细胞的数量是50000个但是实际上稀释加入时每空的细胞量有不同 所以OD值A B处理下来是单位
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