微生物分类学及系统发育.ppt

微生物分類學及系統發育 大綱19 1一般介紹和概況19 2微生物的進化和多樣性19 3分類等級19 4分類系統19 5分類學中使用之主要特性19 6微生物系統發育的評估19 7生命的主要劃分19 8伯杰氏系統細菌學手冊19 9原核系統發育和多樣調查 一般介紹和概況GENERALINTRODUCTIONANDOVERVIEW分類學Taxonomy 希臘語taxis安排或順序 nomos法則或nemein分類或治理 定義為生物分類的科學包含分類 命名和鑑定分類學的重要性讓人們整理有關生物大量的知識 分類愈精細 系統信息愈豐富和愈有用對相似生物的知識 對進一步研究推測和假設將微生物給予精確命名 分成有意義和有用之類群對微生物精確鑑定是必要的 系統學systematics 系統分類學 以分析生物特徵並按順序排列為最終目的的科學研究任何生物特性的研究是系統學的一部分涵蓋了形態學 生態學 流行病學 生物化學 分子生物學和生理學微生物分類使用新的分子技術也介紹許多傳統方法主要以伯杰氏系統細菌學手冊Bergey sManualofSystematicBacteriology 簡稱BMSB以16SrRNA基因序列比對為基礎建構系統 做成分類層級 並把原核生物分為古生物域和細菌域 兩域分別包含2門和23門 微生物的演化和多樣性MICROBIALEVOLUTIONANDDIVERSITY地球年齡估計約有46億年疊層石 stromatolites 和沉積岩中之化石遺骸發現原核細胞約有35至38億年微生物化石清晰地在20億年之岩石上現代疊層石由藍細菌所形成最早原核生物可能是厭氧性藍細菌和產氧之光合作用菌大概在25 30億年或更早隨著氧變得較豐富 微生物多樣性大大增加 1977CarlWoese等學者對原核生物細胞rRNA序列研究後提出原核生物應分為兩個類 群細菌 古細菌真核生物這三個基本類群稱為 域 domains 在門和界水準之上真核生物有甘油脂二酯膜脂glycerolfattyacydiesters細菌生物有diacylglyceroldiesters古細菌dietherordiglyceroltetraetherlipid 醚鍵 現代真核生物細胞起源於14億年前的原核生物 有些化學數據證明在27億年前 兩個假說核 粒線體和葉綠體是由原生質膜內陷形成包含遺傳物質的雙層膜結構形成的葉綠體 粒線體和現代細菌之間的相似性源自於原核生物保留性的胞器緩慢的改變內共生假說 endosymbiotichypothesis 真核細胞祖先可能由古代的細菌和古生菌融合而形成失去了細胞壁之G 宿主細胞吞了古生細菌形成共生古生菌喪失了它的細胞壁和原生質膜宿主細菌形成膜折疊 宿主基因體轉移至古生菌中 形成核和內生網狀在形成真核生物基因體時 細菌和古生菌基因可能皆喪失 很多人認為古生菌和真核生物比親緣關係更近 認為真核生物直接從古生菌分化而來葉綠體的可能源自光合細菌藍細菌是葉綠體最可能的祖先粒線體來源於原始真核生物和好氧呼吸真細菌的共生可能祖先 農桿菌屬 根瘤菌屬和立克次氏體屬內共生的證據藍細菌定居在雙生鞭毛原生生物 作為寄主葉綠體內共生體稱為藍色小體與藍細菌在光合作用色素系統和存有類似肽聚糖層的構造缺少脂多糖外層膜特徵進化成葉綠體 分類等級TAXONOMICRANKS種 屬 科 目 綱和門每個水平或等級的微生物類群的命名都有特定字尾特徵常使用非正式的名稱 如紫細菌 螺旋體 甲烷氧化菌 硫酸還原菌和乳酸菌微生物分類中基本分類類群是種species與高等生物研究的分類學家定義種的概念不同高等生物的種是一群彼此雜交能繁殖或潛在的雜種繁殖的自然群體 對能有性生殖的生物是很好的定義但對不是有性繁殖的微生物則不宜原核生物的種是根據表型和基因型的不同而定義原核生物的種是菌株的一個集合 這些菌株有許多共同穩定特徵而與他類菌株有顯著的區別 此定義非常主觀更精確的定義 一個種 基因型種 是有相似G C組成和有70 或以上之DNA雜交實驗判定之集合由於基因體序列之數據增加 種或許可以定義為具有相同序列種可能是生物其主要管家基因housekeepinggene 所有細胞皆需之基因 其通常持續表達 具有相同序列之集合菌株 strain 在一個特定分類學中至少與其他一些群體可以區別之生物群體 來自單一生物或純培養物的分離株 一個種內其菌株間在許多方面上可能有小差異變種 biovars 是生化或生理上有差異之各色各樣的原核菌株形態變種 morphovars 是指形態上不同血清變種 serovars 則指具有獨特抗原特性模式菌株 typestrain 通常是首先被研究的菌株 其特徵比其他菌株瞭解得多 它不一定是最具代表性的菌株模式種 typespecies 種的模式菌株 是命名的模版或擁有種名每一個種都屬於一個屬 genus 將種置於一個屬有相當主觀 有些分類學家也許不同意屬的組成 微生物學家採用雙名系統 binomialsystem 命名微生物由瑞典植物學家CarlvonLinne所提系統為拉丁化 斜體名稱分為兩部分第一個字母大寫是屬名 第二個字母小寫Escherichiacoli種名常代表特定性質 是穩定的 某一特定生物最早的特定性質有優先權如果由於新的信息把某一個生物分到另一屬中 而改變屬名根據rRNA分析和其他特徵 鏈球菌屬 Streptococcus 分為2個新屬 腸道球菌屬 Enterococcus 和乳酸球菌屬 Lactococcus 糞鏈球菌 Streptococcusfaecalis 現在為糞腸球菌 Enterococcusfaecalis 菌名常被縮寫 屬名用一個大寫字母表示 例如E coli 文章中第二次出現菌名時才可縮寫 第一次出現還是要寫全名 分類系統CLASSIFICATIONSYSTEMS表徵分類法PheneticClassification根據整個相似性將生物分組在一起形成表型系統比較更多的性狀所建立之分類 由許多共同特徵的生物構成一個單獨類群或分類單位依據可能演化關係分組在一起形成系統發育系統數值分類法Numericaltaxonomy依據它們的特徵狀況以數值方法將分類單位分成類群應該比較至少50個特徵 幾百個更合適其特性包括許多不同性質的數據 形態學的 生物化學的和生理學的可比較如RNA和蛋白質等大分子之序列 系統發育分類法PhylogeneticClassification系統建立於演化關係上 而不表徵的相似性缺少好的化石記錄 對於證明原核生物和其他微生物是很困難直接比較遺傳物質和基因產物RNA或蛋白質分類學中使用之主要特性MAJORCHARACTERISTICSUSEDINTAXONOMY經典 傳統 特性ClassicalCharacteristics分子特性MolecularCharacteristics 傳統特性形態特性MorphologicalCharacteristics形態學容易研究和分析形態比較很有價值 因為構造特徵由許多基因所表達 形態相似性常常是系統發育關係密切光學顯微鏡 穿透式和掃描式電子顯微鏡生理和代謝特性PhysiologicalandMetabolicCharacteristics生理和代謝特性直接和微生物酵素和轉運蛋白的本質和活性有關蛋白是基因產物 分析這些特性可以提供微生物基因體間的間接比較 生態特性EcologicalCharacteristics自然界中的生態特性影響微生物與其環境之關係生命循環類型 天然共生關係 對特定宿主致病能力 和棲息地喜好之要求 如溫度 pH 氧氣和滲透濃度遺傳分析GeneticAnalysis大多數真核生物能行有性繁殖 遺傳分析在分類上重要 用有性繁殖定義種經由轉化作用transformation和接合作用conjugation交換染色體基因轉化作用可在不同原核生物 種 間發生 但在 屬 間則非常少 兩個菌株之間發生轉化作用顯示它們關係近 埃希氏菌屬Escherichia能與沙門氏菌屬Salmonella和志賀氏菌屬Shigella接合不能與變形菌屬Proteus和腸桿菌屬Enterobacter接合前3個屬彼此間的關係近於變形菌屬和腸桿菌屬的關係質體對分類將有重要影響 但最好依據許多特性進行分類分子特性MolecularCharacteristics蛋白質的比較ComparisonofProteins蛋白質的胺基酸序列是直接反應mRNA序列 與基因結構緊密相關 比較不同微生物蛋白質對分類學上很有用 最直接方法是測定有相同功能蛋白質的胺基酸序列相同功能蛋白質的序列相似 它們的生物之親緣關係可能較近由於蛋白質測序緩慢又昂貴 所以經常採用許多間接方法比較蛋白質研究種和亞種的親緣關係時 可用蛋白質電泳移動率免疫學技術用於比較不同微生物的蛋白質酵素的物理 動力和調控特性已用於分類學研究 核酸鹽基組成NucleicAcidBaseComposition第一種技術 測定DNA鹽基組成在雙股DNA中A與T配對 和G與C配對 因此DNA中的 G C A T 比值或G C含量 G Ccontent G C百分比反應鹽基序列以DNA解鏈溫度 meltingtemperature Tm 測定 當有50 雙股DNA分開成單股時的溫度稱為熔解溫度雙股DNA中GC有3個氫鏈 AT有2個氫鍵連接 當DNA含高G C含量 其含有較多氫鏈 要在更高之溫度下才能分開 因而其熔點較高 在260nm紫外光吸光度隨著DNA雙鏈分開而升高當緩慢加熱DNA樣品時 吸光度隨著氫鍵斷裂而增加上升曲線的中間點即為解鏈溫度直接測定G C含量DNA的密度隨G C含量直線增加 以CsCl2密度梯度離心即可得知動物和高等植物DNA之G C含量平均約為40 介於30 至50 之間真核和原核微生物DNA之G C含量變異很大原核生物G C含量約25 至80 之間 兩種微生物G C含量差異大於10 代表它們的基因體有較大之鹽基序列差異G C含量非常相似的生物 其DNA鹽基序列也可能差異很大只有在兩種微生物表型也相似 才能認為它們相似顯示它們親緣關係近微生物的分類上 同屬若G C含量差異太遠 這個分類單元可能應該再劃分不同屬之間G C含量 可以改變非常大 但同一屬內改變量常小於10 核酸雜交NucleicAcidHybridization將兩種微生物DNA放在一起 加熱讓雙股到解離然後降溫 控制溫度可得到不同的結果只要兩段DNA互補即可形成雙股 不一定是要與原來互補的那一股配對結合有非放射性DNA鏈之硝酸纖維膜與32p 3H或14C放射性標記的單股DNA片斷當放射性片斷與膜結合之單股DNA雜交之後 除去未雜交單股DNA 測定其放射性放射性的量越強表示親緣越近DNA DNA雜交僅用於研究親緣關係近的微生物親緣較遠的生物則以放射性核糖體或tRNA為材料之DNA RNA雜交實驗來進行比較 核酸定序NucleicAcidSequencing原核生物核糖體50S和30S次單元分離出之5S和16SrRNA序列rRNA是研究微生物進化和相互關係之理想材料所有微生物必要之主要胞器功能在所有核糖體中相同結構隨時間改變非常慢 可能是恆定和必要功能所致rRNA包含可變和穩定序列 所以親緣關係近和非常遠的微生物都能比較 rRNA序列的測定分離和純化RNA 合成互補DNA cDNA 引子是與保守rRNA序列互補 擴增cDNA cDNA序列定序 反推rRNA序列細菌基因體16SrDNA可以直接以PCR放大 然後定序 反轉錄酵素 聚合酵素鏈式反應 PCR 微生物系統發育的評估ASSESSINGMICROBIALPHYLOGENY分子計時器MolecularChronometers核酸和蛋白質的序列隨時間而改變 而稱此為分子計時器1965由Zuekerkandl和Pauling提出此觀念許多rRNA序列和蛋白質隨時間改變 而不會破壞或極少改變它們的功能用分子計時器分析系統發育有些複雜 因有些時期變化特別快 不同分子和相同分子不同部位會以不同速率改變 系統發育樹PhylogeneticTrees用分枝圖或樹的形式說明 一個系統發育樹是由連接節的分支所組成的圖節代表分類單位 如種或基因 外的節 位於分支的末端 代表活的生物樹可以有一個時間尺 或分支的長度可以代表發生在兩個節之間的分子改變的數目樹可以是無根或有根無根樹僅表示系統發育關係 不提供演化途徑有根的樹提供一個節作為那個共同祖先序列間差異的程度以演化距離 evolutionarydistance 表示之 rRNA DNA和蛋白質作為系統發育之指標物rRNA DNAandProteinsasIndicatorsofPhylogeny兩種生物之Sab值 S similarity相似程度 愈高 生物間親緣關係就愈近Sab值可測量演化時間一群很早就分叉的原核生物 其Sab值將會在一個大範圍內 某類原核生物的Sab值範圍愈窄 那麼它就愈現代16SrRNA有一個或多個被稱為寡核苷酸標籤特徵核苷酸序列 寡核苷酸標籤序列 oligonucleotidesignaturesequance 特殊的寡核苷酸序列 大多數或全部之一個特定系統發育類群都有此序列 其他類群很少或從不存在這個標籤序列 各種不同的種和屬分類時 以DNA相似性研究為主較好用G C含量或雜交研究進行比較直接測序比較或分析DNA限制酶片斷多型性restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP DNA比較是根據完整基因體 非一部分以70 親緣關係之標準精確定義一個種更加容易比較許多不同基因體和蛋白質顯示標籤序列存於基因而非其編碼核糖體RNA 蛋白質序列製作系統發育樹優點20種胺基酸構成之系列比由4種核苷酸構成的序列在每個點上有更多信息蛋白質序列比DNA和RNA序列較少受物種特異之G C含量差異的影響蛋白質序列排列較容易 因它不像rRNA序列那樣視二級結構而定不是所有蛋白質都適合於研究發生在長時期大尺度的改變組蛋白和熱激蛋白質不會快速變化免疫球蛋白變化相當迅速 多相分類學PolyphasicTaxonomy系統發育結果隨著分析數據變化而變化分類學家認為所有可能正確的數據都應該被用於測定系統發育利用一系列表型和基因型的信息當分類依據從分子性質到生態特徵血清學技術可以用於鑑定菌株 而非屬或種蛋白質電泳模型對決定種很有用 但不能區分屬或科DNA雜交及G C含量分析可以用於研究種和屬化學組成 DNA探針結果 rRNA序列 和DNA序列能用於定義種 屬和科多性質可得到更穩定和更可靠的結果 生命的主要劃分THEMAJORDIVISIONSOFLIFE大多數微生物學家現在相信生命能分成三個明顯的不同類群域DomainsCarlWoese等人 使用rRNA研究將生物分成三個域 domains 古生菌 細菌和真核生物兩個極為不同的原核生物類群 細菌和古生菌 原核生物中細菌佔了大部分其他的系統發育樹6個或更多與主要域相關聯不同的樹許多因子影響到演化樹的繪製 僅用少數分子的序列會得到不精確的通用樹 3個類群之間是等距 與早期rRNA數據相符 菌和真核生物有共同祖先 細菌可能比其他的域先存在 依賴硫 極端嗜熱原核生物稱為原生細胞 是一個分開類群 與真核生物的關係比古生菌親緣關係近 真核細胞是嵌合的 由一個細菌和一個古生菌融合生成 可能是缺少細胞壁的一個細菌吞食了一個古生菌 細菌 古細菌與真核生物的比較 構建滿意的演化樹的最大困難之一為基因廣泛而頻繁發生水平或橫向轉移真核生物擁有來自細菌和古生菌的基因兩個原核生物域之間有著頻繁的基因交換此種基因移動係來自病毒媒介的轉移因此微生物進化的模型並不像先前認為是線性或樹狀更實際的網狀樹域內基因轉移比域間多 這3個域保持獨立分開常從16SrRNA序列所得的樹 因這些數據極其廣泛 大多數微生物學家採用 界Kingdoms大多數細菌學家承認為三域系統時 許多原生生物學家 植物學家和動物學家仍認為生物分為5或5個以上的界RobertH Whittake於1960年代提出的五界系統分類生物依據至少三個主要標準分為五界細胞類型原核的或真核的單獨的和群體的單細胞組織或多細胞營養類型許多生物學家不接受五界系統理論 主要是古生物和細菌缺少明確區別原生生物界也許太多樣性以致於無分類學用處褐藻可能與植物親緣關係不相近 五界系統將它置於植物界 5界 6界 Cavalier Smith8界 採用了超微細結構特徵和rRNA序列和其他分