从衣康酸发酵废菌丝体中提取蛋白质的研究.doc

已录用稿件从衣康酸发酵废菌丝体中提取蛋白质的研究*Protein recovery from the mycelium residue of itaconic acid fermentation李丕武1,2 陈西广1,* 刘建军2 刘春生2 王令充1（1.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛，266003；2.山东省食品发酵工业研究重点实验室，山东济南，250031）（1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao, P.R. China, 266003；2.The Key Lab of Food and Fermentation of Shandong, Jinan, P.R. China, 250013）摘要:本文研究了衣康酸工业化生产中所产生的土曲霉废菌丝体的主要组成成分，用碱液提取的方法进行了蛋白质的提取回收实验，考察了NaOH溶液浓度、用量、加热温度及时间对菌丝体脱蛋白效果的影响，结果表明衣康酸菌体脱蛋白的最优条件为：NaOH液浓度0.5mol/L，碱液用量为菌丝体的40倍，90C条件下加热9小时。在此条件下，菌体脱蛋白率为86.28%，碱液中菌体蛋白沉淀的等电点为3.4,蛋白沉淀率达到52%。关键词：衣康酸，废菌丝体，饲料蛋白Abstract: The effects of four factors (the concentration and the quantity of NaOH, the temperature and the heating time) on the protein recovery were studied on the base of the analysis of mycelium residue of itaconic acid fermentation. The optimum yield (86.28%) of protein was obtained with 40 times (w/v) alkali addition (NaOH 0.5mol/L) under 90C for 9 hours. Furthermore, the maximum protein sediment (52%) appeared at pH 3.4.Key words: itaconic acid; mycelium residue; feeding protein作者简介：李丕武（1970-），男，博士研究生，研究方向：发酵工业清洁生产技术*：基金项目：国家自然科学基金 (30670566)*：通讯联系人衣康酸(Itaconic acid)又名甲叉丁二酸，分子中含有一个双键和两个羧基，是一种化学性质非常活泼的化学合成中间体,被广泛应用于化工、医药、食品、造纸、纺织、印刷等领域1。目前，衣康酸主要以玉米淀粉为原料采用土曲霉（Aspergillus terreus）深层发酵工艺生产2,3，工业生产规模日益扩大。发酵结束后会产生大量的土曲霉废菌丝体残渣，发酵液过滤后产生的湿渣重量占发酵液总量的2%。由于其中有少量衣康酸残留，因此适口性较差，无法直接作为动物的饲料，生产企业采用的处理方式只能是锅炉焚烧，或置于空场堆放，待风干后集中填埋。由于菌体久置会自溶，并产生难闻的气味，尤其是夏季，从废菌丝体中流出的污水和散发出的恶臭对厂区周围的环境造成严重污染，而且会成为厂区内杂菌滋生的发源地。因此有必要对废菌丝体进行综合治理。与此同时，我国养殖业对饲料蛋白的需求量日益增加，例如饲用大豆蛋白的70%依靠进口4，因此，从废弃菌渣中提取蛋白质，扩大饲用蛋白的生产渠道，具有积极的现实意义。1材料与方法1.1 实验材料实验用土曲霉菌丝体分别取自吉林华侨集团生化公司和山东凯翔生化公司。实验所用药品均为分析纯1.2 实验方法1.2.1 蛋白质的测定方法蛋白质的测定采用微量凯氏定氮法 GB/T1477193脱蛋白率的计算：W1：菌丝体中总的蛋白含量；W2：脱蛋白碱液中蛋白含量1.2.2 灰分的测定：称取菌丝体样品5g置于烘干的坩锅内，在电炉上烧至无烟后放入马福炉中，于550C灼烧2-4小时，直至恒重（两次称重之差不大于0.2毫克），称出灰分重量，按如下公式计算菌丝体的灰分：1.2.3 粗脂肪的测定 采用索氏抽提法51.2.4 粗纤维的测定采用GB/T5009.10-2003中的方法1.2.5 菌体蛋白中的氨基酸成分析采用日立835型高速氨基酸自动分析仪2 结果与讨论2.1 菌体成分的分析首先对衣康酸废菌丝体的主要成分进行了分析，分析结果见表1。表1 土曲霉菌体成分测定结果Table 1 The composition analysis of Aspergillus terreus mycelium蛋白含量（%）粗纤维（%）粗脂肪（%）灰分（%）47.1230.74.042.01从表1可以看出，衣康酸发酵菌丝体中主要成分为蛋白质，含量占菌体干重的近一半，这部分蛋白质如果随废菌体一起白白扔掉非常可惜，对这部分蛋白质进行提取，作为饲料蛋白出售，能够产生一定的经济价值，而且，还可以进一步从提出蛋白质的菌渣中提取其它有价值的成分如：几丁质、食用纤维等6，并实现废菌丝体的综合利用。实验中采用碱法提取菌体中的蛋白质7。利用衣康酸生产中离子交换树脂再生产生废碱，将菌丝体中的蛋白质和其它的碱不溶性成分分离，然后用酸调pH至蛋白质等电点，使其中的蛋白质沉淀出来并回收，工艺路线如图1。图1 碱法提取衣康酸菌体蛋白工艺路线图Figure 1 The flow diagram of protein recovery from mycelium2.2 菌丝体的洗涤废菌体由于经过长时间的堆放，在菌体表面会产生一些杂质，因此在提取之前需要清洗一下，通常采用的方式有两种：酸洗和碱洗。本研究分别用2%的HCl和2%NaOH对菌丝体进行清洗，具体方法是，分别将6倍体积的酸液和碱液与菌丝体混合，置于摇床160rpm，30C条件下充分混和2小时，然后用相同体积蒸馏水洗菌体，水洗后的菌体在60C下干燥至恒重，清洗结果见表2，从表中看出，用碱洗菌体时菌体的损失量大，抽滤困难，不易操作，因此，本研究结果认为选择酸法清洗菌体较为合理。表2 菌丝体洗涤方法对比Table 2 The comparison of mycelium washing methods 条件菌体状态液体颜色SS*菌体损失率%酸洗无变化黄绿25碱洗吸水膨胀深褐515*：SS为手持折光仪显示的固形物含量2.3 碱法脱蛋白条件的研究通过单因子实验证明NaOH溶液浓度、用量、加热温度及时间对菌丝体脱蛋白效果有影响，利用这四个因素不同水平的正交实验来确定NaOH溶液脱蛋白的最佳条件。正交实验设计及结果见表3和表4。从表4结果可以看出，影响NaOH溶液脱蛋白率的各因素主次顺序为:加热温度NaOH溶液体积NaOH溶液浓度加热时间。随着温度的升高，脱蛋白率不断上升，但当温度达到90C时，脱蛋白率随着温度升高的趋势变缓；最佳的碱液加量为菌体重量的40倍；随着碱浓度的升高，脱蛋白率逐渐降低；脱蛋白率随着加热时间的延长而升高，但是当作用9小时后，变化不太明显，因此选择9小时为最佳条件。综合考虑，选择较优脱蛋白条件为：NaOH液浓度0.5mol/L，碱液用量为废菌丝体的40倍，在90C下加热9小时，在此条件下进行蛋白分离实验，菌体脱蛋白率为86.28%。表3 NaOH溶液脱蛋白正交实验条件Table 3 Design of factors and levels in orthogonal test of protein recovery with NaOHNaOH浓度(mol/L)NaOH加量(倍)加热温度(C)加热时间(h)水平10.520503水平2140706水平3260909表4 NaOH溶液脱蛋白正交实验结果Table 4 The result of the orthogonal test of protein recovery with NaOH因素水平试验ANaOH浓度BNaOH体积C温度D时间脱蛋白率（%）12345678911122233312312312312323131212331223170.25479.82178.85175.1576.84771.41774.81973.43571.785k1k2k376.30974.47173.34673.40876.70174.01871.70275.58576.83972.96275.35275.812R2.9633.2935.1372.852.4 菌体蛋白等电点的测定用HCl滴定法考察了菌体蛋白液的等电点，在一组试管中加入相同的菌体蛋白液，用盐酸分别调至不同的pH值，常温下静置4小时，从外观可以看出，当pH值调至3.4时，菌体蛋白沉淀的量最多，上清液透明，此时的沉淀提取率为52%，从图2的HCl滴定曲线也可以看出当pH范围为3-4时，加入很少量的HCl，pH值曲线就产生明显的变化，说明该菌体蛋白的等电点为3.4。图2 衣康酸菌体蛋白液的滴定曲线Figure 2 Titration curve of mycelium protein solution2.5 衣康酸菌体蛋白成分分析使用日立835型高速氨基酸自动分析仪对从衣康酸菌体中提取的蛋白质进行氨基酸成分的分析，结果见表5。表5 衣康酸菌体蛋白氨基酸成分分析结果Table 5 The amino acid analysis of mycelium protein名称百分含量g/100g名称百分含量g/100g门冬氨酸6.38酪氨酸2.48苏氨酸0.88苯丙氨酸2.96丝氨酸0.74赖氨酸2.45谷氨酸8.87氨0.21甘氨酸2.95组氨酸0.5丙氨酸3.49精氨酸0.99胱氨酸0.39脯氨酸2.23缬氨酸4.65色氨酸/蛋氨酸1.5亮氨酸7.56异亮氨酸3.14从表5中可以看出，衣康酸菌体蛋白中氨基酸种类丰富，谷氨酸、赖氨酸含量最高，是一种优良的饲料蛋白，具有很好的开发应用前景。3.小结综合考虑，选择较优脱蛋白条件为：NaOH液浓度0.5mol/L，温度90C，作用9小时，碱液体积为40倍，在此条件下，菌体脱蛋白率为86.28%。衣康酸菌体蛋白沉淀的等电点为3.4左右。菌丝体脱蛋白后剩余的碱不溶性部分还有潜力进一步提取几丁质、食用纤维等成分。参考文献1 Yahiro K et. al. Breeding of Aspergillus terreus Mutant TN-484 for Itaconic Acid Production with High YieldJ.Journal of Fermentation Biology，1995， 79：506-508.2 Riscaldati E et. al. Effect of pH and stirring rate on itaconate production by Aspergillus terreusJ. Journal of Biotechnology，2000，83：219230.3. Bonnarme P et. al. Itaconate Biosynthesis in Aspergillus terreusJBacteriol，1995，177：3573-3578.4 丁国文