微生物培养标准作业程序.doc

微生物培養標準作業程序強場物理與超快技術實驗室 製作製作人：劉奕成更新日期：20100720一、 注意事項：1. 在每次開始操作前，需先確認耗材存量是否足夠，及早採購預備。2. 所有操作步驟中，要進入生物操作櫃的物品，都必定要均勻噴灑過 70% 的酒精才可進入生物操作櫃。自己的手，需洗淨後擦乾後戴上手套，進入生物操作櫃之前，也需均勻噴灑過酒精，以下的步驟不一一註明。3. 操作時請在酒精燈火的附近操作，以增加空氣循環，避免污染樣本。4. 為了避免污染，微生物培養所使用的器材不可與細胞培養所使用的器材共用，包括所有的器皿、工具、培養箱與生物操作櫃，冰箱可共用但建議分層存放，離心機可共用通常微生物使用的是高速離心機。5. 本文件操作的地點在中央大學科四館517室不可在313A操作，注意其內部隔間之生物操作櫃與培養箱是細胞培養用的。有問題請洽該室生物助理林芷芸小姐TEL：03-4227151#36311。二、 每次操作前的準備步驟：1. 開啟生物操作櫃風機與紫外光燈管電源，殺菌1015分鐘後切換至日光燈照明。2. 手掌至手肘部分均用洗手乳洗淨，擦乾後戴上手套。三、 本示範文件所使用的藥劑如下：1. sample：大腸桿菌Escherichia coliwild type2. medium：LB (tryptone broth)I. bacto-tryptone 1%II. NaCl 0.5%III. yeast extract 0.5%IV. redistill water 98%3. autoclaved glycerol四、 標準作業程序：A. 培養1. 準備試管、酒精燈、大腸桿菌與medium，可多準備一張沾有70%酒精的擦手紙方便隨時清潔用。2. 開啟medium前，先用火烤瓶口以殺菌。3. 吸取3 ml medium。4. 取空試管，開啟前先燒烤瓶口以殺菌，將medium注入空試管中。5. 用最小的pipet吸一點細菌有吸到即可。6. 將細菌注入裝有medium的試管中，傾斜試管以讓medium接觸到pipet。7. 斜放至有震動功能的生物培養箱，小心試管底部不要接觸到培養箱底部，避免摩擦。震動的目的是增加與空氣接觸的面積，所以瓶口不可轉太緊，使空氣可以跑進去。8. 生物培養箱的溫度設定37.0度C，震動速度設定260 RPM。9. 微生物大約是15分鐘會複製一次，經過1520個小時後生長的情況會最好，將試管取出，此使內部應該長滿微生物並且呈混濁狀。B. 保存1. 準備autoclaved glycerol抗凍劑、空的Eppendorf與沾有酒精的擦手紙方便隨時清潔用。2. 吸取500 l 50%的抗凍劑autoclaved glycerol，注入空的Eppendorf中。3. 吸取細菌500 l與抗凍劑一樣多，注入裝有抗凍劑的Eppendorf中。4. 將裝有細菌與抗凍劑的Eppendorf在震動機上震動約3秒鐘，使之均勻混合。5. 放入-20度C冰箱冷凍保存，可使用313A之冰箱。C. 清理1. 將剩餘的液體倒入燒杯中。2. 加入鹼性洗潔精，攪拌使之產生泡沫，利用鹼性打破細胞膜達到殺菌的效果，大部分的細菌皆有效。3. 試管用刷子清洗要產生泡沫並用清水沖乾淨。4. 最後用2次水沖洗試管清除殘留顆粒。5. 蓋上蓋子不用轉太緊放入高溫滅菌鍋滅菌，維持110