Immunhis protocol.doc

一、 免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学。(一) 对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。-对抗体的要求：纯度高、比活性强；*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。(二) 抗原 (antigen, Ag)*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。*根据抗原是否显示免疫原性分为：完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。(免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性) 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。(半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性)。载 体通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。（三）抗体 (antibody, Ab)1、抗体的概念：*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。-抗体主要存在于血清内；抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血 (1) 动物的选择选择什么动物来免疫取决于：所需抗血清的量 :小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。能供免疫用的抗原量 :小鼠50&61549;g足够，而山羊需要几毫克。动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。(2) 佐剂 (adjuvant)*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 *最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant) ;弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant, FIA)是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。(使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂) 弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA)是在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml)，即成为FCA。*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。一. 佐剂与抗原乳化的方法:*研磨法(适于制备大量的佐剂抗原)：先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。*注射器混合法: 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内,交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。缺点：不易乳化，时间长。*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。-每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收集。优点：简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定-判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。(3) 免疫方法免疫途径*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。*几点说明：-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100&61549;g抗原即可获得较好的免疫效果。-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。 (3) 免疫方法次数及间隔时间*次数一般为23次(初次免疫和加强免疫)-首次注射后，1015天再加强注射；-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长-豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天；-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例1：家兔的免疫 *初次免疫-用50200&61549;g Ag加入FCA，在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml，也可肌肉内或皮内注射；*两周后，加强免疫-将50200&61549;g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；-10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2550&61549;g；-末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。举例3：豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫-用10100&61549;g Ag加入FCA，在背部皮内注射46点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；*加强免疫-每隔 78天，将1050&61549;g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；(4) 免疫剂量*抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；*免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量(5) 抗体效价的检测多采免疫双向扩散法 一【基本原理】*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。1. 免疫双向扩散法的操作步骤:*将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。*将1agar 融化后，置56水浴。*在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。*中心孔加5&61549;l 抗原样品，周围孔内每孔加5&61549;l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。*凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。*观察结果。2. 抗体效价检测的其它方法*环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；*对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；*酶联免疫吸附试验 (ELISA)。3放血或定期抽血 常用以下3种方法*颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。*心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。*静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。注意:采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血;血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。二、组织和细胞标本的制备*标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件*免疫组化对组织和细胞标本的要求-保持所检标本原有的结构、形态；-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。*免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本*组织标本 -石蜡切片 -冰冻切片*细胞标本 -组织印片 -细胞培养片(细胞爬片) -细胞涂片(一) 石蜡切片*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法-最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；-石蜡块还能长期存档，供回顾研究。*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事项*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃；镊取组织动作要轻；经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液*取材后的组织需立刻投于固定剂中-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）-醇类（常用乙醇）-其它 （丙酮）(1) 醛类*甲醛(福尔马林)应用最广-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。-缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 -注意事项：缩短固定时间，降低固定温度(4&61616;C)，为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液，减少固定液pH的变化。*固定后充分水洗以减少分子间交联。*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。*戊二醛：穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。*多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。(2) 醇类* 最常用的醇类固定剂是乙醇。固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。优点：穿透性强、抗原性保存好。缺点：脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)；乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。(3) 其它固定剂*丙酮：对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修复原因*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复方法*修复液： -最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液； -最新研究表明碱性修复液更有效，推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。方法：*化学方法*加热方法：水浴加热法；微波照射法；高压加热法；酸水解法(1) 化学方法*主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。-胰蛋白酶：一般使用浓度为0.050.1，消化时间为37，1040min，主要用于细胞内抗原的显示；-胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%0.4，消化时间为37、30180min，主要用于细胞间质抗原的显示。*例如：Laminin、CollagenIV(2) 水浴加热法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。-优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，-缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3) 微波照射法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。(4) 高压加热法暴露抗原*将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压23min，可取得极好的效果。*由于高压下受热均匀，特别使用于大批量标本的染色。(5) 酸水解法*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。*将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室温作用20min(温度升高，作用时间缩短)。*此法能增强特异性染色，降低背景，但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项 :达到规定的温度(9295以上)；维持一定的时间；避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)；加热后必须经过室温自然冷却2030分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型；4、载玻片的处理*抗原修复过程中，由于高温、高压等诸多固素的影响，极易造成脱片。为防止脱片，常用粘附剂处理载玻片。-新载玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自来水冲洗后再用蒸馏水清洗；用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的载玻片再用粘附剂处理。*常用的粘附剂有：-APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）-Polv-L-Lysine（多聚赖氨酸）-铬明胶溶液（1）.3-氨丙基三乙氧基硅烷APES(3-aminopropyltriethoxysilane )*现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);*将洗净的玻片浸于此液中2030秒钟；*取出稍停片刻，再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES，置通风橱中晾干或60烤箱烤干。（2）Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)*将清洁玻片浸于100&61549;g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37放置30min，然后60烤箱烘烤1h或室温过夜干燥。装盒备用。（3）铬明胶溶液*试剂：铬明矾(chrome alum) 0.25g明胶(gelatine) 2.5g ; 蒸馏水 500ml*先将铬明矾溶解于40少量蒸馏水中，再加入明胶及蒸馏水，可在70 水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。如有残渣，可过滤后再用。*用时稍加溶化，切片浸入23min，过夜晾干。(二) 冰冻切片*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。-缩短了制片时间-抗原性不受损失*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。1、冰冻组织块的常用方法*液氮中冰冻：组织投入液氮中 (一196)中1020sec；*干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至一70 ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好；-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70冰箱。2、切片*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂；*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25 。切片厚度一般为48um。3、切片后处理*切好的冰冻切片，室温下自然晾干12h后，入4&61616;C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20。*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。(三) 组织印片*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20保存。(四) 细胞培养片(细胞爬片)*贴壁细胞培养时，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20固定1020min)，再进行免疫染色。-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。(五) 细胞涂片*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括：-血液、尿液、脑脊液；-体腔积液；-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。*细胞涂片的方法： 1.手涂法: 将细胞浓度调节到106/ml左右，可直接涂于载玻片上，但要均匀、不重叠。图片范围应小于1cm直径，以节约试剂。 2.涂片机涂片法: 将细胞样品制成21056/ml 细胞悬液，吸取50100&61549;l (121045cells) 加入涂片机内，1000rpm离心2min后细胞就均匀分布于玻片上。三、免疫组化常用的染色方法*根据标记物的不同分为免疫荧光、法免疫酶标法、亲和组织化学法(一) 免疫荧光法【原理】用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原；荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪；借助于荧光显微镜进行观察。1、常用的荧光素*(1) 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)*(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)*(3) 四乙基罗丹明 (RB200)*(4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)(1) 异硫氰酸荧光素(FITC)-易溶于水和乙醇；最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为 520530nm呈翠绿色荧光，分子量 389.4；在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与Ig的自由氨基形成共价键，成为标记的荧光抗体。一个lgG分子上最多能标记1520个FITC分子。(2) 四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)-最大发最大吸收光谱550nm，射光谱620nm，呈红色荧光，分子量为444；与蛋白质结合的方式同FITC。(3) 四乙基罗丹明(RB200) -不溶于水，易溶于乙醇和丙酮；最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为595600nm，呈橙红色荧光，分子量为580；RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯(SO2Cl)，在碱性条件下，易与蛋白质的赖氨酸&61541;-氨基反应而标记在蛋白分子上。(4) 碘化丙啶(PI)-是常用的DNA荧光标记探针，可作为FITC的胞核对比染色；PI可嵌入到双链DNA和RNA碱基对中并与之结合，但对碱基无特异性选择；最大吸收光谱是493nm，最大发射光谱是630nm，呈红色荧光。2、荧光抗体的保存一要防止抗体失活，二要保持荧光素不脱落和不受激发猝灭；一般认为04可保存12年，-20可保存34年；要小量分装，防止反复冻融；保存前需加防腐剂 (浓度为1:500010000的硫柳汞或1:10005000叠氮化钠) 。3、免疫荧光的染色方法 *免疫荧光染色法常用的有-直接法和间接法原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 (用来检测未知抗原)。直接免疫荧光法的操作步骤1.标本的处理：-细胞涂片、细胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min 3/次；-石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min 3/次；2. 2%BSA或10%BSA37湿盒内封闭30min3. 抗体染色：-在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37孵育30min；&61547;直接免疫荧光法的操作步骤(续)4. 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。5. 缓冲甘油封片-分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 *镜检：在荧光显微镜下观察。*优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。*缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。&61549;直接免疫荧光法的注意事项: 对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察； 染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；染色温度：多采用室温(25)，高于37可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2&61616;的低温，延长染色时间；低温染色过夜较37 30 min效果好的多；一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。试验时需设置下列对照：-自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。-阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。-特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法&61546; 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。-可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。&61547;间接免疫荧光法操作步骤：*标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；*一抗染色：-加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37作用30min或4过夜。*0.01M PBST漂洗5min3次(震荡漂洗)； * 加荧光标记的二抗抗体，37湿盒避光作用30min。*0.01M PBST避光漂洗5min3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；*甘油缓冲液封片*镜检优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。&61549;间接免疫荧光法的注意事项1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。2.每次试验时 ，需设置以下三种对照：-阳性对照：阳性血清+荧光标记物-阴性对照：阴性血清+荧光标记物; -荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3. 标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4. 一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。(二) 免疫酶酶标法【原理】以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。1、常用的标记酶及其显色底物*辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物*碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物*HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；底物为过氧化物和供氢体(DH2)-过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。-供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。DAB (二氨基联苯胺)-DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。(2) 碱性磷酸酶(AP)及底物*AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：-偶氮偶联反应，底物为&61537;-萘酚磷酸盐，经水解后得&61537;-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。-靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法*又分为以下两种方法：-酶标抗体法：直接法和间接法-非标记抗体酶法：酶桥法和PAP法(1) 酶标抗体法*通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，与标本进行反应后，再用酶组化法将酶显色，使之生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，以供光镜和电镜观察。-优点：切片能长期保存、反复观察，适于镜下半定量分析。-缺点：酶与抗体形成的共价键，可损害抗体和酶的活性；易产生非特异染色。(1) 酶标抗体法直接法&8226; 将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。(1) 酶标抗体法间接法*将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标抗体间接法的操作步骤*标本准备：-石蜡脱蜡至水；-冰冻切片浸入4&61616;C丙酮固定10min，0.01M PBST漂洗，5min3；-细胞爬片先用PBS洗，然后4&61616;C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min3；*石蜡切片需要进行抗原修复，其它标本则不用；*封闭内源性过氧化物酶：3H2O2-甲醇溶液室温孵育510min (湿盒内) ；*0.01M PBST漂洗，5min3；*510%正常山羊血清(0.01M PBS稀释)封闭，室温孵育30min (湿盒内) ；*倾去血清勿洗，加1BSA(PBST配制)稀释的一抗， 37孵育60min 或4过夜(湿盒内)；*0.01M PBST漂洗，5min3；*加HRP标记的二抗室温孵育lh或37 30min ；*加0.01H2O20.05DAB显色 (显色液应新鲜配置)；*经PBS漂洗3次后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，明胶甘油封片，显微镜观察。(2) 非标记抗体酶法酶桥法*首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；*以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；*再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的分布-优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。但抗酶抗体不易纯化。几点说明*一抗(假设来自种属A)的稀释度可大些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合。*二抗桥抗体(抗种属A的IgG抗体)应过量，使其Fab段一个与一抗结合，另一个则游离。*因抗酶抗体与一抗均系种属A IgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起桥作用，将其连接在与组织抗原结合的一抗上。(2) 非标记抗体酶法PAP法与酶桥法相似，不同的是，PAP法将酶桥法的第3、4步并为1步，用PAP复合物代替;PAP是离体制备的复合物(HRP-抗HRP)；显色与酶桥法相同，PAP复合物中的过氧化物酶催化底物水解，形成不溶性终产物。PAP法评价*PAP法比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。由于常做石蜡切片，故可用于回顾性研究。(三) 亲和组织化学法*是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。生物素抗生物素染色法原理：生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。该系统一端偶联大分子生物反应体系，另一端连结标记物，后者加入酶的底物，产生颜色反应。(1)标记抗生物素生物素法(labelled avidin-biotin method, LA)：分为直接法和间接法。*直接法 用生物素标记第一抗体，与抗原结合；酶标记抗生物素，与生物素结合，然后进行酶呈色反应。* 间接法 用生物素标记二抗，酶标记抗生物素，先用第一抗体与组织抗原结合，再将第二抗体与第一抗体相连结，最后进行呈色反应。(2)桥抗生物素一生物素法(bridge avidin-biotin method，BRA)-此法是用生物素分别标记抗体和酶，以抗生物素为桥，把二者连接起来，进行呈色反应。(3) 抗生物素-生物素-过氧化物酶法-ABC法*ABC法是在BRAB和LAB的基础上改良的方法；ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的；分为直接法和间接法。-直接法是生物素标记的一抗与ABC复合物结合；-间接法是生物素标记的二抗与ABC复合物结合。ABC法的评价：*敏感性强：ABC法比PAP法敏感性高2040倍。*特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，一抗和二抗都可被稀释至可能的浓度，减少了非特异染色。*方法简便，节约时间。可由PAP法所需的2天缩短至几个小时。 *由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫。免疫细胞化学方法步骤 固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）：我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml 磷酸氢二钠 48.693g 磷酸二氢钠 5.023g三蒸水 1000ml12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 多聚甲醛 125g 三蒸水 1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60以下，如仍不溶，加少量NaOH（三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml）4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 12.5%多聚甲醛 320ml 0.1m PB 680ml步骤：1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。2 PBS清洗标本 3次 各 1 min。3 冰丙酮固定 15 min。4 空气干燥 5min。5 PBS清洗标本 3次 各 2 min。6 0.5%Triton X-100( DPBS配 ) 孵育 1次 20 min。7 PBS清洗标本 3次 各 2 min。8 3%H2O2孵育 15 min。9 DPBS清洗标本 3次 各 2 min。10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液） 20min。11 一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12 PBS清洗标本 3次 各 5 min。13 二抗工作液孵育（湿盒） 37OC 30 min。14 PBS清洗标本 3次 各 5 min。15 C液（湿盒） 37OC 30 min。16、PBS清洗标本 3次 各 5 min。17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约310min。18、蒸馏水洗 2次 1 min。19、苏木素复染 0.51min。20、自来水洗 30min。21、树胶封片。各部注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片； 接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4OC冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易掌握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断摸索和探讨的事，但最基本的应从以下方面加以注意：（1）去除内源酶及内源性生物素 一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中自身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免疫组化染色在特异性情况下进行。 1) 去除内源酶 常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反应，出现气泡现象，易对组织结构和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即使有些血细胞在显色后也出现棕黄色反应，但由于其形态结构与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比较通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，最好室温10min。 2) 去除内源性生物素 在正常组织细胞中也含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。 3) 灭活碱性磷酸酶 最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.68.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。 （2）抑制非特异性背景着色 非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用1030min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。 （3）缓冲液 免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.27.6，最常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/L TBS pH8.2缓冲液比较好。 （4）抗原修复 经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。 抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种： 1胰蛋白酶(Trpsin) 主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%，37作用10min。 配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。 2胃蛋白酶(Pepsin) 主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37作用30min。 配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。 3热引导的抗原决定簇修复(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER) HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的pH值非常重要，有效的抗原修复pH值要比修复液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐渐增强，但最佳pH值范围为6.010.0，对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复，有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH 值l.03.0和6.08.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液，所以两种抗原修复液可作为相互替补的进行抗原修复。在进行HIER过程中应防止切片的干燥，加热时必须达到规定的温度，保温时间要足够，对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理，否则对染色无益，