氯化锶治疗去卵巢大鼠骨质疏松的实验观察.doc

氯化锶治疗去卵巢大鼠骨质疏松的实验观察作者：张兆川【摘要】 目的：研究氯化锶对切除卵巢雌性大鼠骨质疏松的影响及作用机制。方法：通过切除大鼠卵巢建立骨质疏松模型,随机分为治疗前组、对照组、低剂量组、高剂量组和假手术组，每组10只，治疗12周,观察治疗前后模型动物骨代谢及血清和尿中相关指标的变化。结果:低剂量组和高剂量组的骨密度（BMD）明显高于对照组,高剂量组的BMD接近假手术组;低剂量组和高剂量组的血清骨钙素明显高于对照组,尿羟脯氨酸/肌酐低剂量组和高剂量组低于对照组。低剂量组和高剂量组TRAP活性降低,接近正常组水平。结论：锶盐对骨质疏松模型鼠有增加骨量的作用,且具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重功效。 【关键词】 氯化锶 骨质疏松 去卵巢大鼠 骨质疏松是一种骨量降低和骨组织结构改变,导致骨脆性增加及易发生骨折的全身性疾病1。目前,全世界大约有2亿人患骨质疏松,其发病率已经跃居世界各种常见病的第7位,其中大多数是中、老年人,并且以绝经后的妇女占绝大多数1。国内外防治骨质疏松症的药物颇多,但大多不能有效地增加骨量,不能使已疏松的骨骼恢复正常。寻找能直接加强骨组织和拮抗骨吸收的药物是目前医学研究上的难点和热点。体内外实验提示锶盐能增加骨质矿化度及密度,直接抑制骨溶解,阻止骨钙的释放。国内外已有人把雷尼酸锶用于动物骨质疏松的防治,据报道它可改善疏松的骨组织。 本实验改用氯化锶进行治疗,探讨锶对去卵巢大鼠骨质疏松的作用,为进一步研究其影响骨代谢的机制和临床应用提供实验和理论依据。 1 材料与方法 1.1 主要药物 氯化锶由德国Levo公司合成(分析纯,99.999),骨钙素(BGP) 试剂盒由北京北方生物免疫技术研究所提供。尿羟脯氨酸(HOP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒由南京建成生物技术研究所提供。 1.2 主要仪器 美国Lunor 公司DPX 双能X 线骨密度扫描仪,中国科技大学射线计数器。 1.3 实验动物及分组 健康纯种SD 大鼠50 只,4月龄,雌性,体重(249.5813.47)g,由徐州医学院动物中心提供。随机分为治疗前组、对照组、低剂量组、高剂量组和假手术组5组，每组10只。手术方法: 5%氯胺酮注射液按100 mgkg-1给大鼠腹腔注射,麻醉成功后无菌条件下取腰椎两旁切口进入腹腔背侧,在双侧肾脏下方脂肪组织内确认卵巢后完整切除卵巢,止血缝合;假手术组仅切除卵巢旁部分脂肪团块，立即关腹。 1.4 给药方法 骨质疏松模型建立后,治疗前组术后8周处死大鼠测骨密度（BMD）;对照组每天给予蒸馏水5 ml 灌胃,共12周；低剂量组每天用氯化锶溶液5 ml (0.3 mmolkg-1d -1,蒸馏水倍比稀释)灌胃给药,疗程12周 ;高剂量组每天用氯化锶溶液5 ml(1.2 mmolkg-1d-1,蒸馏水倍比稀释)灌胃给药,疗程12周;假手术组术后自由饮食、摄水。 1.5 指标及方法 BMD测定:处死大鼠后取背部切口暴露脊柱,切取腰段脊柱,去除肌肉。将标本相当于仰卧位放置于双能X 线BMD仪(DPX2IQ Lunar CO 美国)探头下,应用动物软件对其L4进行扫描(Mode2HiRes,Votage276 kV,Current150 A)。 血清BGP测定：心脏采血,分离血清,按照BGP放免测定试剂盒说明书操作程序测定。尿HOP测定:于大鼠处死前停药,置入代谢笼中收集24 h 的尿液,用氯胺T 氧化法测定。尿肌酐(Cr) 测定:用盐酸苦味酸盐法取尿样品,应用全自动生化分析仪(7150 日立公司日本) 自动打印测定。TRAP用生化方法检测，碱性磷酸酶ALP，血清Ca、P用自动生化分析仪（7150日立公司日本）打印测定。 1.6 统计学处理 实验数据用 x- s 表示,以单因素方差分析和组间q检验作统计学处理。 2 结 果 2.1 大鼠骨质疏松模型判断 大鼠双侧卵巢摘除8 周后,腰椎BMD治疗前组与假手术组相比,差异有统计学意义。见表1。表1 各组腰椎BMD 测量结果1)与假手术组比较，P<0.052.2 氯化锶对骨质疏松大鼠腰椎BMD 的影响 对照组大鼠腰椎BMD较假手术组明显降低。治疗12周后,与对照组和假手术组相比,低剂量组、高剂量组的腰椎BMD明显升高,差异有统计学意义；高剂量组与低剂量组之间差异有统计学意义。见表2。表2 各组腰椎BMD 测量结果1)与对照组比较，P<0.05； 2)与假手术组比较，P<0.05； 3)与低剂量组比较，P<0.052.3 氯化锶对骨质疏松大鼠血清BGP 及尿HOP水平、HOP/Cr的影响 对照组大鼠血清BGP 水平明显高于假手术组,差异有统计学意义。氯化锶治疗12周后,低剂量组和高剂量组血清中的BGP水平与假手术组和对照组相比，差异有统计学意义；高剂量组与低剂量组之间差异有统计学意义。尿中HOP排泄量,低剂量组、高剂量组和假手术组明显低于对照组;低剂量组与高剂量组尿HOP/Cr差异无显著性。见表3 。 2.4 氯化锶对骨质疏松大鼠血清钙（Ca)、磷(P)及ALP、TRAP的影响 氯化锶治疗12 周后,各组血清Ca、P值无明显改变,对照组及氯化锶治疗组ALP值较假手术组明显升高(P<0.05),高剂量组ALP值高于对照组,但差别无显著性。对照组TRAP明显升高，通过锶盐治疗12周，低剂量组和高剂量组TRAP降低，接近假手术组。见表4。 3 讨 论 女性的骨骼发育有其规律性,骨质疏松症的预防和治疗特别强调年龄段。女性绝经后采用雌激素、降钙素、双膦酸盐制剂等药物的治疗主要是针对骨吸收环节,减少骨丢失,起到预防骨质疏松症的作用。然而很多绝经后妇女在就诊时已处于低骨量甚至是脆性骨折阶段,降低骨转换率的药物不能明显提高骨量2,因此对于骨质疏松症患者,理想的药物应具有减弱骨吸收并同时增强骨形成的治疗作用。表3 各组血清BGP 及尿HOP、HOP/Cr测量结果 锶是16世纪在苏格兰的铅矿石中发现的一种可用来作为骨标记的微量元素，它与放射性锶的不同之处在于放射性锶对骨细胞有毒性作用，而不具放射性的锶对骨可以产生有益作用34。体外试验证明，锶盐可以增加ALP（成骨细胞分化的标志）的活性，同时在不影响骨基质矿化的前提下增加骨系统胶原的合成，证明了锶盐在活体外对骨形成活性的影响4。 活体动物实验也证实，锶盐在活体内可减少骨吸收同时增加骨形成，最终促使脊柱和四肢的骨量和骨强度增加5。 去卵巢大鼠是公认的模拟绝经后妇女骨质疏松的动物模型。一般大鼠3月龄时性腺和内分泌系统完全发育成熟,肌肉骨骼系统基本成形,12月龄时达高峰,因此3 12月龄,尤其是3 9月龄为复制成年骨质疏松大鼠的合适年龄。雌性成年大鼠切除双侧卵巢8周后即可造模成功。本实验采用4月龄大鼠，卵巢切除8周后，测量显示BMD明显降低。同时，实验中观察到反映骨形成的指标（BGP、ALP）和骨吸收的指标（HOP、TRAP）同时升高，骨吸收及骨形成均增强,骨转换率升高,提示卵巢切除后致大鼠骨质疏松模型属高转换型骨质疏松。骨代谢生化指标在模型期均发生了明显改变。 测定BMD是判断骨质疏松症最基本的依据,目前不同的非侵入性骨矿物质测量中,最引人注目的是双能X线吸收法(DEXA) 。应用DEXA测量大鼠腰椎BMD,结果表明4月龄大鼠卵巢摘除8 周后骨质疏松模型造模成功。造模成功后给予模型鼠摄入锶盐溶液，DEXA测量大鼠腰椎BMD表明锶盐有增加骨量的作用。 BGP是骨组织中的一种能结合Ca的蛋白质,其与羟基磷灰石结合而沉积在骨组织中。BGP 主要由骨中的成骨细胞合成随后释放入血6,血中的BGP 水平基本可以反映骨中的BGP 水平6,它是反映机体骨转换和骨形成的特异指标7。本实验模型期骨质疏松组BGP 降低,说明骨质疏松组骨形成降低。锶盐治疗12周后的结果提示锶盐具有抑制破骨细胞的功能,同时也显示了其可影响成骨细胞的活性。与以往报道雷尼酸锶治疗结果相似8。 HOP 主要存在于胶原中,由于胶原主要存在骨组织,因此尿HOP 的排泄量可以作为骨吸收和骨转换的指标9,由于HOP受尿浓缩影响,通常用尿Cr 来校正。本实验中，对照组HOP排泄量明显升高，予以锶盐治疗12周后，治疗组HOP排泄量接近假手术组，提示模型鼠的骨吸收与骨转换降低，证明锶盐有抑制骨吸收降低骨转换的功效。 本实验中可观察到各组大鼠血清Ca、P之间无显著性差异，对照组的TRAP与ALP均升高，锶盐治疗12周后治疗组的TRAP降低，接近于假手术组，ALP明显升高，提示锶盐对内环境矿物质的稳定没有不良影响,反映骨形成的指标BGP及ALP升高,反映骨吸收的指标HOP及TRAP却明显下降,出现了骨形成与骨吸收的解耦联现象。 从本次实验生化、BMD等各种指标的结果综合分析,氯化锶能拮抗骨吸收，降低骨转换，同时可以增加骨形成，可能是一种治疗骨质疏松的有开发潜力的药物。 骨质疏松病人治疗的最终益处是对抗骨折。尽管BMD和骨强度高度相关,但单纯骨量增加,骨质量不一定相应增加,骨骼的生物力学性能和骨组织微结构的改变也是重要的疗效指标10,因此,锶盐对骨生物力学性能和组织计量学的影响还需要进一步探讨。【参考文献】 1郭世绂,罗先正,邱贵兴.骨质疏松基础与临床M 天津:天津科学技术出版社,2001: 175261.2STEGMAN M R,RECKER P R,DAVIES K M,et al.Fracture risk asdetermined by prospective study designsJ.Osteoporos Int,1992,2 :290297.3MARIE P J.Effects of strontium on bone formation and bone cellsM/NEVE J,CHAPPUIS P,LAMAND M.Therapeutic uses of traces elements.New York:Plenum Press,1996:277282.4PORS N S.The biological role of strontiumJ.Bone,2004,35(3):583588.5BPARBARA A,DELANNOY P,DENIS B G,et al.Normal matrix.mineralization induced by strontium ranelate in MC3T3E1 osteogenic cellsJ.Metabolism,2004,53(4):532537.6AMMAN P,SHEN V,ROBIN B,et al.Strontium ranelate improves bone resistance by increasing bone mass and improving architecture in intact female ratsJ.J Bone Miner Res,2004,19(12):20122020.7王大申,张梅.骨钙素与骨代谢J.国外医学内分泌分册,1985,(4): 180.8DAVID M S,JOHN S A,ROBERT M N,et al.Deficient production of 1,25dihydroxy vitamin D in elderly osteoporosis patientsJ.N Engl J Med,1981,1:305.9DELMAS P D.Biochemical marker of bone turnover for the clinical assessment of metabolic bone diseaseJ.Endocrinol Metab Clin North Am,1990,19:1.10MARIE P J,HOTT M,MODROWSKI D,et al.An uncoupling agent containing strontium prevents bo