VE对去卵巢大鼠血清TSOD、GSHPX活力与心肌细胞凋亡的影响.doc

VE对去卵巢大鼠血清TSOD、GSHPX活力与心肌细胞凋亡的影响作者：李政媛,张婷婷,陈宇豪,国智超,张翔,赵单位：吉林医药学院，吉林 吉林【摘要】 目的 以去卵巢大鼠为更年期动物模型,观察心肌细胞抗氧化能力与凋亡的变化，探讨维生素E（VE）对老年心肌细胞凋亡的影响机制。方法 以正常成年大鼠（假手术组）和去卵巢大鼠（老年对照组）为对照，实验组大鼠腹腔注射VE：5 mg/kg（小剂量组)、15 mg/kg（大剂量组)，连续注射9周。采用比色法测血清中总超氧化物歧化酶(TSOD)与心肌组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活力，Hoechst染色法检测细胞凋亡。结果 实验组大鼠血清TSOD与心肌GSHPX活力高于去卵巢大鼠，低于假手术组；大剂量组TSOD与GSHPX活力高于小剂量组；Hoechst荧光染色显示，VE大剂量组大鼠心肌细胞凋亡明显少于小剂量组，但多于假手术组，小剂量组心肌细胞凋亡与去卵巢组相似。结论 大剂量VE可提高心肌抗氧化能力，减少心肌细胞的凋亡，延缓围绝经期妇女心肌细胞的衰老。 【关键词】 维生素E 总超氧化物歧化酶 谷胱甘肽过氧化物酶维生素E（VE）是具有抗氧化作用的维生素，其结构与雌激素相似，可通过抑制自由氧对细胞的氧化而起到保护细胞、延缓衰老的作用。VE对生殖系统的功能维持也具有重要作用，研究表明1，对于自然衰老雌性大鼠，VE通过抗氧化、抗自由基作用，可延缓卵巢细胞的衰老，提高血清雌激素水平，通过雌激素受体表达的上调，增加抗氧化酶的表达来起到减少心肌细胞凋亡的作用。但在体情况下，VE单独作用对减少心肌细胞凋亡的作用并未进行揭示。本研究用去卵巢大鼠为衰老动物模型，给予不同剂量的VE，观察VE对衰老大鼠心肌细胞凋亡的影响，进一步探讨VE对心肌细胞凋亡影响的机制。 1 材料与方法 1.1 模型制备与处理 Wistar成年雌性大鼠32只，10月龄,体重(230±20)g，购于吉林大学白求恩医学部实验动物中心。随机分成4组：正常对照组（假手术组）、去卵巢对照组（老年组）、去卵巢小剂量VE组、去卵巢大剂量VE组。大鼠适应1周后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,固定,背部切口去双侧卵巢，假手术组切除一小块脂肪,分层缝合。去卵巢1周后,阴道涂片,已无性周期变化。对照组大鼠腹腔注射植物油,实验组大鼠按5 mg/kg和15 mg/kg腹腔注射VE,每日1次,持续9周。 1.2 实验材料 VE注射液购于上海通用药业股份有限公司；植物油为食用色拉油；总超氧化物歧化酶(TSOD)、心肌谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活力及Hoechst凋亡试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。 1.3 生化指标的测定 大鼠摘眼球取血，4冰箱静置过夜，3 000 r/min离心10 min，取上清液，-20冰箱保存待测。血清TSOD活力采用黄嘌呤酶法。以铜锌SOD(CuZnSOD)与锰SOD（MnSOD）相加为TSOD。每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位。测定时每份血清样品取20 μl，按试剂盒说明书操作，结果以活力单位/毫升（U/ml）表示。 取心肌组织匀浆后离心取上清液，稀释至2%，取样品0.2 ml测GSHPX活力。规定为每毫克蛋白质，每分钟扣除非酶反应的作用，是反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位，结果以活力单位/毫克蛋白（U/mg pro）表示。 1.4 Hoechst检测细胞凋亡 剪下心脏，主动脉逆行插管，用100 ml预冷的生理盐水(4)灌注心脏后，换以40 g/L多聚甲醛灌注固定1 h，然后置入同浓度多聚甲醛溶液中浸泡固定10 h，常规石蜡包埋及组织切片，片厚5 μm，常规脱蜡处理后进行Hoechst33258染色，荧光显微镜观察拍片。 1.5 统计方法 实验数据用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 11.0统计软件包，进行组间t检验。 2 结 果 2.1 TSOD活力、GSHPX活力比较 各组血清TSOD活力、心肌匀浆GSHPX活力比较见表1。表1可见，老年对照组TSOD、GSHPX活力明显低于假手术组（P<0.01）；实验组大鼠的TSOD、GSHPX活力明显低于假手术组（小剂量组P<0.01，大剂量组P<0.05），实验组大鼠与老年对照组相比TSOD、GSHPX活力虽有所增加，但无显著性差异，大剂量组TSOD、GSHPX高于小剂量组，亦无显著性差异。 2.2 HoechstPI染色法检测细胞凋亡 大鼠心肌细胞凋亡情况如图1，蓝色荧光表示发生凋亡的心肌细胞，荧光强表示凋亡程度重。由图1可见，假手术组只有少数荧光，细胞凋亡少；大剂量组染色较多，细胞凋亡比假手术明显增多；小剂量组与表1 大鼠TSOD和GSHPX活力比较与假手术组比较，*P<0.05，*P<0.01； 3 讨 论 女性进入老年期后，随着机体衰老，活性氧生成增加，而清除能力下降，氧自由基攻击生物膜，使膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化2。在生物体内清除活性氧的体系主要包括：SOD、GSHPX、其它抗氧化酶及谷胱甘肽、生育酚等抗氧化剂。SOD是生物体内最为重要的抗氧化酶之一，能特异清除超氧阴离子，但研究发现，该酶可与H2O2形成复合物(SODH2O2)而失活2。GSHPX可分解细胞液中形成的过氧化物，防止羟自由基和单线态氧的生成，减少自由基的积累。二者在体内的水平可一定程度上代表体内的抗氧化能力的变化。这可以在赵红等3的研究中得到证明。 在我们的实验中观察到：TSOD、GSHPX的活力在实验组虽高于老年对照组，但并没有显著的差异，而假手术组明显高于其它各组。说明：VE可提高老年心肌抗氧化能力，但作用有限，其主要抗氧化作用是通过增加体内雌激素水平，通过雌激素途径发挥的。 心肌细胞的凋亡情况也表明，小剂量VE在单独作用时，虽可小幅度的提高机体的抗氧化能力，但并没有抑制心肌凋亡的作用；大剂量使用可有效抑制老年心肌细胞的凋亡。由于活性氧本身在体内能产生破坏性更强的羟自由基，少量就能诱导多种细胞凋亡45。大剂量VE的抑制老年心肌细胞凋亡作用可能与大剂量的VE解除了SODH2O2复合物中的H2O2，SOD活性增加有关；同时大剂量的VE由于其自身的抗氧化能力的提高，也可有效的减少心肌细胞的凋亡。而小剂量VE这种作用较弱，无法有效阻止心肌细胞产生羟自由基，达到抑制凋亡的作用。假手术组心肌细胞凋亡很少是雌激素对心肌细胞的强大的保护作用所致。而且，在无雌激素条件下，VE通过基因调控途径发挥的作用是否发生改变，在本实验条件下，仍无法推测，有待进一步探索。 综上所述，VE可轻度提高体能的抗氧化能力，对衰老雌性大鼠心肌的抗氧化作用有所贡献，在没有雌激素参与的情况下，VE单独抗心肌衰老的能力有限，需在很大剂量下，才能发挥明显的抗心肌细胞衰老的作用。在进行VE的临床使用时，可配合其它药物使用。【参考文献】 1 赵行宇，王月鹏，孔亚坤，等.维生素E对老年雌性大鼠血清雌二醇及心肌细胞Bcl2的影响J.吉林医药学院学报，2008，29（1）：12.2 谢书阳,杨玲玲,陈 浩,等.Aβ和氧自由基诱导的培养神经元凋亡及维生素E的保护作用J.中国老年学杂志,2005,25(4):436438.3 赵 红,张玉媛,马儒林.大豆异黄酮对高脂血症大鼠体内SOD、GSHPx活力及MDA含量的影响J.实用全科医学,2005,3(3)：191192.4 Forrest V J,Kang Y H,McClain D E,et al.Oxidative stressinduced apoptosis prevented by TroloxJ.Free Radic Biol Med，1994，16(6):675684.5 Lennon S V,Martin S J,Cotter T G.Do