酶学第五章酶催化动力学基础.doc

第五章 酶催化动力学基础5.1 引言酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影响酶促反应速度的因素包括S、E、P、I、A、pH和温度等。本章重点讨论S对酶促反应速度的影响，并且介绍一些基本概念，和简单体系的动力学方程的推导。5.2 反应级数和速度常数5.2.1 反应级数化学反应的级数就是动力学方程中影响反应速度的各反应物浓度项上的指数之和。5.2.1.1 零级反应反应速度与底物的浓度无关，称为零级反应。当S大大高于E时，可认为是零级反应。 （4.1）， （4.2）。积分（4.2）式得， （4.3）。也即，故P与t成正比，k0为该零级反应的速度常数，它表明单位时间底物的减少量或产物的生成量，因次为“Ct1”。零级反应的半寿期（即一半底物转化成产物所需的时间）可以由 代入式（4.3）求得 ， ， （4.4）。与S0成正比，与k0成反比。5.2.1.2 一级反应反应速度与底物浓度成正比（单底物反应），称为一级反应。当E S时为一级反应。 （4.5）， （4.6）。式中k1为一级反应速度常数。将式（4.6）积分得， ， 。即 （4.7）。将t对作图可得一直线，斜率为， k1的因次为“t1”。将代入式（4.7）可以得出 ， （4.8）。在一级反应中，与k1成反比，而与底物浓度无关。5.2.1.3 二级反应反应速度与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应，这种反应可以是两个相同的反应物反应生成产物（2S P），也可以是两个不同的反应物反应生成产物（AB P）。先看第一种情况（2S P）： （4.9）， （4.10）。式中k2为二级反应速度常数。将（4.10）积分得， ， （4.11）。t对作图可得一直线，斜率k2，截距。K2的因次为“C1t1”。将代入（4.11）可求出 ， ， （4.12）。与k2及S0都成反比。零级反应中S0越大，也越大；二级反应中S0越大，反而越小；一级反应与S0无关。再看第二种情况（AB P）：，如果A = B，则与第一种情况的全部推导和结果相同。如果两个反应物中，SA比SB大得多，即SA SB，反应中SA下降的相对值很小，可以认为保持恒定，此时反应速度只与SB成正比，其动力学方程式与一级反应的相同，其反应的速度常数用kobs表示，称为表观反应速度常数。这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应，kobs在这里也是假一级反应速度常数。当SA SB时，有，式中 （4.13）。在恒定SB和不同的SA时测定反应速度，得出不同SA时的kobs，再按（4.13）作图，斜率即为k2。如果SA和SB相差不大，情况比较复杂，这里不作讨论。5.3 酶催化反应动力学方程5.3.1 反应初速度的测定在研究酶反应动力学时，一是改变各种因素（如S、I、pH等），二就是测酶反应速度。随着酶反应的进行，底物浓度逐渐下降，产物逐渐积累，酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，人们采用酶反应的初速度作为衡量的指标。从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从近0处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切线无法作准确。实际使用的初速度测定方法有以下几种：5.3.1.1 高底物浓度测定法高底物浓度测定法即零级反应近似法。它采用S10Km的条件，在中，Km可以忽略不计，VVm，即与零级反应近似，V为一恒定值，此法必须在无高底物浓度抑制时才适用，为了避免产物抑制，应在反应的初期测定。5.3.1.2 低底物浓度测定法低底物浓度测定法即一级反应近似法。它采用SKm的条件，在中，分母中的S可以忽略不计，在不同S时测定V，以V对S作图，直线部分的斜率为。在直线部分，S乘以得V。5.3.1.3 使用不同酶量的测定法在加不同酶量的情况下测反应速度，作出产物生成量对反应时间的图，然后以酶量对反应速度作图，此反应速度为反应了不同时间的速度平均值，以不同的反应时间分别作曲线，在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。5.3.2 E对反应速度的影响在S过量的情况下，V对E成正比；而在E一定时，S与V成双曲线关系。若酶催化单底物反应机理为ES EP，则V = k ES，也就是V与E及S都成正比，但实际情况不是这样，这个结果符合以H+为催化剂的情况。若假设底物和酶先形成ES复合物，再由ES转化成产物，其机理可写成ES ESEP并假设第一步可迅速平衡，第二步较慢，是限速步骤。根据这些假设可推导出动力学方程式： ，在此式中，V与E0成正比，而与S成双曲线关系，符合实际情况，故假设的机理正确。5.3.3 单底物单产物反应5.3.3.1 酶底物复合物的存在经过电子显微镜观察、x光衍射和动力学方法研究，证实了确实有ES复合物存在。5.3.3.2 平衡学说（Henri, Michaelis和Menten 方程）1902年Henri和Brown提出了SE ES EP学说；1913年Michaelis和Menten完善了这个理论，他们的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。ES ES EP在推导动力学方程时，有几点假设：第一步迅速平衡，第二步慢，即k2 k1；S E，S ES；酶以E和ES两种状态存在。设Vf为E与S结合的速度，Vr为ES解离的速度，则Vfk1 ( E0ES )( SES )， Vrk1 ES， 平衡时VfVr ， k1 ( E0ES )( SES )k1 ES ， 又 S ES， SESS， k1 ( E0ES ) Sk1 ES， ，解出 ES 得 ，令Ks， 则 ，由于V = k2 ES，代入前式得。因为当所有的E都成为ES时，可达最大反应速度，即Vm = k2 E0 ，所以 ，这就是米氏方程。5.3.3.3 稳态学说（Briggs-Haldane修正公式）1925年，Briggs和Haldane提出稳态学说。他们认为，许多酶催化反应的k2很高，k2不仅不特小于k1， 而且远比k1大，即ES分解成E和P的速度比解离成E和S的速度快。该学说认为，在反应进行了一段很短的时间后，ES由0增加到一定数值，然后保持不变，即达到稳态水平，这时生成ES的速度与ES分解和解离的速度相等。ES生成的速度=k1E ( SES )k1ES，ES解离和分解的速度k1ESk2ES = (k1+ k2) ES ，在稳态时， 即k1ES = (k1+ k2) ES ， E = E0ES， k1(E0ES)S = (k1+ k2) ES ，k1E0Sk1ESS = (k1+ k2) ES ，k1E0S = k1ESS +(k1+ k2) ES， k1E0S = (k1S + k1+ k2)ES ，ES = ， 设Km = ，ES = ， 将V = k2ES 代入得， 。平衡法与稳态法所得的动力学方程形式完全一样，只是Ks和Km的区别，Ks =，Km =；当k1 k2时，k2可以忽略不计，Km转变成Ks 。5.3.3.4 Haldane关系公式1930年，Haldane提出了一个关系公式。考虑到酶催化的反应有一些是可逆反应：正反应速度Vf ， 正反应的米氏常数Kmf = ，逆反应速度Vr，逆反应的米氏常数Km r = ，当可逆反应达到平衡时，ES的解离达到平衡，即k1ESk1ES， ES的分解也达到平衡，即k2ESk2EP， ， Keq 。Keq为可逆反应平衡时的平衡常数，也是平衡时产物P和底物S的浓度比。， ， Keq （Haldane关系公式）由此可见，正逆反应的Vm和Km都不同，但最终的Keq是相同的。5.3.3.5 有两个中间复合物时的米氏方程用稳态法推导（推导略） V=King-Altman对动力学方程的推导King-Altman根据矩阵原理，采用图像的方法简化了方程的推导过程。具体方法如下：a 写出反应历程并安排成封闭的几何图形；b 写出所有的n-1线图形，图形必须涉及全部的酶存在形式；c 按照King-Altman图形，写出每种酶形式的浓度和总酶浓度之比的代数式；对于E：箭头都指向E。 含有E的各项常数和k1k2k1k3k2 k3 = a ；对于ES：箭头都指向ES。含有ES的各项常数和k1k2Sk1k3Sk2k3Pb ；对于EP：箭头都指向EP。含有EP的各项常数和k1k2Sk1k3Pk2k3Pc ；则各种酶形式的浓度与总酶浓度之比为， ， 。d写出速度方程， 将EP和E代入上式得，5.3.3.6 米氏方程的积分形式米氏方程是一个微分方程， 或 ，根据米氏方程采用作图法求Vm和Km时，要测不同S下的反应初速度，要求反应转化掉的S不超过S0的5%，但有时P太少不易检测。采用积分速度方程，就可以使用不同反应程度的数据，例如可以把10%90%的S0转变成P这个范围内的测定数据都用于作图，以求得Vm和Km 。但还有一些限制条件，如无产物抑制，Keq很大等。， ， 或 。这样测定几个不同时间（t）的P或S，以对作图，得到按此法作图，从一个比Km大几倍的S0（如 S10Km ）开始，并且使反应进行到S显著低于Km（如 S0.1Km 时，都能得到很好的分布点。5.3.3.7 米氏方程所作图的特征在较广范围S的变化中，V随S的变化而变化，并表现出三个性质不同的动力学区域。当S0.01Km时，V对S基本上是直线关系，反应速度与S成正比，这对底物来说为一级反应，对酶来说也是一级反应。当S100Km时，反应速度不依赖于S，V与S无关，这对底物来说是零级反应，但对酶来说是一级反应。当S0.01Km和S100Km时，为混合级动力学区域。A一级反应动力学当S0.01Km时，米氏方程中的S可以忽略不计，所以 ，而一级反应速度是与S成正比的，即 ，反应速度又是单位时间底物S的减少率，即 ，从这3 个式子可以得出下列关系：。一级反应速度常数k的物理意义是：在任何时间t时，现存底物在单位时间内的转化比值。如果用求k值不方便时，可用下列方法求k值：a积分法求k值：， 。 以lg S 对t作图可得一直线，其斜率为。b半寿期法求k值：一半底物反应生成产物所需的时间为半寿期。当t时， ，由得 ， ，按上图求出，即可求出k值。B零级反应动力学当S Km时， ， 。5.3.3.8 米氏方程的意义我们讨论米氏方程的几个特点及应用。A反应速度与底物浓度之间的关系aV和S的关系为一双曲线：将米氏方程整理可得双曲线方程的标准形式。当S为正值时，此式的图形是双曲线位于第四象限的一支。与标准双曲线（）相比，（虚线是原轴）米氏方程的纵轴右移了Km，横轴下移了Vm。b特定的V和S值：当S Km时，V = Vm ，这是酶被底物全部饱和时所能达到的最大反应速度。当SKm时，V=Vm ，Km可定义为反应速度达到最大反应速度一半时的S。当S Km时，此方程有两个含义。一是在S很低时，V和S呈直线关系；二是为二级反应速度常数，这个常数可作为比较催化效率的一个特征常数。在同系列底物中，最大的是该酶的最适底物。c任何两个Vm分数时的S之比为常数：当V = 0.9Vm时，S9Km ；当V = 0.7Vm时，SKm ；当V = 0.1Vm时，SKm ；， 。BKm的意义Km是酶的特征性常数，但必须固定在某一反应条件下（pH、温度、离子强度等）才能保持不变。若一个酶可以催化多种底物反应，则对不同底物有不同的Km值。a计算V达到Vm的百分率：，已知Km和S，可知反应速度达到最大反应速度的百分率。b要达到一定的，需要多大的S：c寻找天然底物：找Km值最低或最大的底物为天然底物。如黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase）既可催化黄嘌呤氧化，又可催化醛的氧化，因其Km值分别为0.05mmol/L和10mmol/L数量级，故将此酶命名为黄嘌呤氧化酶。木糖异构酶（Xylose isomerase）也能催化D-葡萄糖异构成D-果糖，但因其催化D-木糖转变成D-木酮糖的Km值较低，故称为木糖异构酶。d判断在细胞内酶是否受S的调控：了解酶的Km和细胞内的S可以推测该酶在细胞内是否受S的调控。当S Km时，S的稍微变化不会使V有多大变化；反之，如果S Km，则V对S的变化十分敏感。己糖激酶同工酶存在于肝中，对葡萄糖的Km10mmol/L，而己糖激酶同工酶存在于多种组织中（尤其是肌肉中），它们对葡萄糖的Km0.04mmol/L。在禁食状态下，血糖浓度大约为3mmol/L，这时同工酶的反应速度已达到Vm（98.7%Vm），而对同工酶只有23%Vm。当摄入食物后血糖水平达到约9.5mmol/L，这时同工酶的反应速度仍然是Vm（99.6%Vm），而同工酶的V达到49%Vm。这说明同工酶受血糖浓度的调控，而同工酶不受此因素调控。由此可见，肝中的己糖激酶同工酶能够在血糖浓度升高时，使糖原合成的速度加快。e判断在细胞中酶催化反应的主要方向：根据酶催化正反两个方向反应的Km及体内两向的S，可以判断体内反应进行的方向。f寻找限速步骤：根据代谢途径中各步反应酶的Km和相应的S，推测限速步骤。g作为判断同工酶种类的依据：同工酶对同一底物的Km往往不同，而具有同工多形性的非同工酶（蛋白质修饰方式不同）对同一底物的Km常常是相同的。据此可以判断不同来源催化相同反应的酶是否同工酶。h判断酶和底物亲和力的大小：当k1 k2时，KmKs =， Km越小，表明酶与底物的亲和力越大。为酶与底物的亲和常数。CVm及k2的意义当S Km时，Vmk2E0，可通过k2来求k2。这时的反应为假一级反应，k2是表观一级反应速度常数。若E0用活性中心当量表示，则k2表示每个活性中心在单位时间内催化的底物分子数，即转换数。k2又称催化常数，用kcat表示。5.3.3.9 Km和Vm的求法ALineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）， 两边取倒数得 。以对作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为，横轴截距为。B Hanes-Woolf作图法给双倒数式两边同乘以S得 。以对S作图，在一定范围内可得一直线。 直线的纵轴截距为，横轴截距为Km 。CEadie-Hofstee作图法， KmVSV = VmS， SV = KmVVmS，。以V对作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为Vm，横轴截距为。5.3.3.10 偶联酶反应中的动力学问题A用偶联酶的实验问题若被测酶反应的产物不便于测定，可偶联一个酶，。若E1和E2的反应条件差别较大，可在E1反应一段适当时间后，终止反应（加热等）。然后改成适合E2反应的条件，加入E2和必须的辅底物，反应适当时间使S全部转化成P，再测定P的量。问题是第二阶段要反应多久，才能使最大限度的S转化成P。从“5.3.3.6米氏方程的积分形式”中的积分方程可得，式中和分别为偶联酶的最大反应速度和偶联酶对S的米氏常数，S0为第一步反应的产物浓度，也是第二步反应的初始底物浓度。从理论上计算，当S下降到很低时，反应为一级反应，若要使100%的S转变成P，需要无限长的时间。假如我们确定要使98%的S转变成P，这个误差是可以接受的。设KmE2 = 2104mol/L，VmE2 = 5105mol/L/min（等于0.05国际单位/ml的酶量），第一步反应积累的S01104mol/L，则将98%的S转变成P所需的时间为：17.6 min18 min利用这个积分方程，我们也可以先确定反应时间，再计算需要加多少酶。VmE2与酶量的换算关系：1mol/Lmin1mmol/ml/min =1000mol/min/ml =1000国际单位/m