卵母细胞体外成熟评价标准的改良研究.doc

卵母细胞体外成熟评价标准的改良研究作者：杨永杰,孙淑玉,马水英,姜晶晶单位：山东大学 1. 附属省立医院生殖医学中心，济南 250021【摘要】目的 探讨改良式人未成熟卵母细胞评分标准的可行性和颗粒细胞指标的合理性及其对卵子发育潜能的影响。方法 体外培养卵丘-卵母细胞复合体，按改良式人未成熟卵母细胞评分标准，将未成熟卵母细胞分为优质卵和非优质卵，对成熟卵母细胞进行受精，并对胚胎进行评价；用琼脂糖凝胶电泳检测两类卵的颗粒细胞凋亡。结果 优质卵的成熟率、卵裂率和优质胚胎率都优于非优质卵，优质卵成熟数和优质胚胎数与非优质卵比较差异有统计学意义（P<0.01）；非优质卵其卵丘细胞DNA凝胶电泳后形成明显DNA 梯带，凋亡程度高于优质卵的卵丘细胞。 结论 改良式人未成熟卵母细胞评分标准在临床上具有可行性。 【关键词】 卵母细胞；体外成熟；评价研究；细胞凋亡 YANG Yongjie1, SUN Shuyu2, MA Shuiying1, JIANG Jingjing1, LI Mei1, HU Jingmei1, LI Yuan1 (Shandong University 1. Center for Human Reproduction of Shandong Provincial Hospital, Jinan 250021, China； 2. School Hospital, Jinan 250100, China) To study the feasibility of the improved scoring system by evaluating oocytes cultured in vitro, and to discuss the relationship between developmental potential of human immature oocytes and their granulasa cells. Methods Cumulus enclosed oocyte complexes (COCs) were cultured, evaluated and fertilized. The IVM oocytes were morphologically classified into two groups based on the improved scoring standard. One group was of high quality and the other group was of poor quality. Granulosa cell apoptosis was detected by agarose gel electrophoresis. Results The immature oocyte scoring system was improved. The maturation rate，cleavage rate and high quality embryos of high quality oocytes were better than those of poor quality oocytes. DNA of granulosa cells distilled from poor quality oocytes was discovered as DNA ladder，while that from high quality ones was not. Conclusion The improved scoring standard is feasible in clinical practice. Key words: Oocytes; In vitro maturation; Scoring system; Apoptosis 1 材料与方法 1.1 未成熟卵的获取、培养与体外受精 114例患者均就诊于山东大学附属省立医院生殖医学中心，2631岁，平均年龄（28.2±3.2）岁，不孕年限平均（3.9±2.7）年。共计取卵154个周期，移植114个周期（74.0）。于患者月经周期1012?d肌注人类绒毛膜促性腺激素（hCG）10000?IU，36?h后在异丙酚静脉麻醉下，行未成熟卵取卵术。随后将卵丘复合体放入含有0.075?IU促卵泡激素（FSH）、0.5?IU hCG、10?ng/mL表皮细胞生长因子（EGF）、0.29?mmol丙酮酸钠、10胎牛血清的TCM199中，在37?，5CO2环境中培养，2830?h后去除卵丘细胞，评价卵母细胞成熟情况。有第一极体释放的被认为是成熟卵，即行单精子卵细胞浆内注射（ICSI）。1618?h后，卵细胞浆内如出现双原核，即为正常受精，继续在胚胎培养液中培养24?h后进行胚胎评分，后行宫腔内胚胎移植。 1.2 卵母细胞评分 取出的卵泡液在保温条件下立即送入细胞培养室，在体视显微镜下将卵子挑选出来，并在倒置显微镜下进行卵子质量和成熟情况的评价后进行体外培养，评价培养后的卵母细胞。根据卵母细胞中有无细胞核将未成熟卵母细胞分为MI期和GV期。其中GV期卵母细胞胞浆内有生发泡；MI期未成熟卵母细胞无第一极体，且胞浆内无生发泡。根据Smitz等1对未成熟卵的分级标准，去掉核成熟程度和颗粒细胞的扩展程度指标，采用颗粒细胞层数指标和卵子形态指标，简化了卵子的分级数（原分6级），避免了原分级方法复杂,实验室应用中受到一定限制的局限性。修改后制定的改良式人未成熟卵母细胞评价标准将卵分为优质和非优质2类。优质卵：粘液团丰富，卵细胞形态规则或基本规则，周围颗粒细胞层完整，层数>3层，扩展良好，或紧密包裹在卵子周围；非优质卵：卵细胞形态有不同程度的不规则，颗粒细胞层不完整，层数≤3层，或有其它形态结构异常，或无法清楚分辨卵细胞形态。 1.3 胚胎发育评价 参照Dale的标准2，稍做修改后3，对受精后的胚胎每天一次进行评分，除移植的胚胎外对其它胚胎进行34?d的连续观察和评分。多数胚胎中途退化，少数发育至桑椹胚。根据形态将胚胎分为优质胚胎（卵裂球均匀或轻度不均, 核碎片≤15 %）和非优质胚胎（卵裂球轻度不均或不均，核碎片>15%）。优质胚胎宫腔内移植14?d后检查血βhCG，确立生化妊娠，32?d后B超检查，发现胎芽和原始心管搏动，则确立临床妊娠。 1.4 琼脂糖电泳检测卵丘颗粒细胞凋亡 分别收集单卵的卵丘颗粒细胞，按优质卵母细胞的颗粒细胞和非优质卵母细胞的颗粒细胞分类，经蛋白酶K、10十二烷基磺酸钠（SDS）处理，放入37?的水浴箱中轻摇过夜后，提取核DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 1.5 统计学处理 采用SPSS 11.0统计学分析软件，行χ2检验，P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 卵母细胞评分标准 未成熟卵母细胞评分见图1。优质卵泡(图1AB);非优质卵泡(图1CF)。2.2 卵母细胞评分标准与卵母细胞发育潜能 在临床实践中所取卵子质量不同。少数取出时已退化或死亡，或已分解（无卵）；大多数的卵子部分在培养后发育至M期并完成受精，部分停止于GV、M、M期，少数因外界刺激而自裂。受精后有些形成单原核，有些不能进一步卵裂，有些卵裂但发育到桑椹胚的却很少，大部分在取卵后第46天停止发育并退变死亡。在移植的114个周期中，统计60个取卵周期共计826个卵(形态不清的卵子未计算在内)，其发育潜能见表1。表1 培养至第3天时卵母细胞的发育情况2.3 本评分标准中颗粒细胞指标与卵母细胞发育潜能 根据卵子的评分标准之一颗粒细胞（granulasa cells，GCs）的层数将卵子分为：GC<3的卵子、5≥GC≥3的卵子和GC≥6的卵子。颗粒细胞层数与卵发育情况见表3。GC≥6的卵成熟率、卵裂率与前二者比较差异无统计学意义(P0.05)；而优质胚胎率则明显高于GCs层数少的卵，与GC<3、5≥GC≥3的卵子优质胚胎率比较差异有统计学意义（P<0.01,P0.05），5≥GC≥3卵的优质胚胎率与GC<3比较差异有统计学意义（P<0.05）。表3 颗粒细胞层数与卵发育情况 非优质卵母细胞其卵丘细胞提取DNA后经琼脂糖凝胶电泳后形成明显DNA 梯带；优质卵母细胞其卵丘细胞提取DNA经琼脂糖凝胶电泳只形成12条大分子量DNA条带（图2）。3 讨 论 3.1 改良式人未成熟卵母细胞评分标准的可行性 在IVM中，所取卵子的质量状况复杂，挑选高质量、具有良好发育潜能的卵子进行培养非常必要。从卵母细胞到胚胎，出现了一系列评分系统。理论上讲，挑选由最好的卵母细胞受精发育而来、各期评分都最好的胚胎能获得最高的胚胎着床率。单纯就卵母细胞的评价来讲，尚无既简单易行、又能较准确评价卵母细胞质量的评分标准。本研究将未成熟卵母细胞按照细胞核的成熟度分为GV 期和MI 期,再将未成熟卵母细胞分为优质和非优质两大类。之所以没有按GV 期和MI 期分别细分，是因为已有资料表明，卵母细胞核成熟度分级可能是不必要的4。对该改良式人未成熟卵母细胞评分标准的研究表明，该评分系统具有简单易行，高效可靠的特点，卵子的分值可较好地反映卵母细胞的发育潜能。既利于优质胚胎的选择又可减少显微注射的工作量，是一种有效可行的评价系统。 3.2 评价标准中颗粒细胞指标与卵母细胞发育的关系 颗粒细胞对卵母细胞的核成熟、胞浆成熟和保护其发育潜能有重要的作用，体外培养保留卵丘细胞可促进更多的卵母细胞发育成熟，增加优质胚胎率5。在IVM中，卵母细胞核成熟和质成熟不同步与卵丘细胞有关，其机制有待研究6。在IVM中，卵的筛选标准之一是颗粒细胞的层数及完整性。研究表明，所取卵周围的颗粒细胞层数越多，颗粒细胞越完整，越有利于卵以后的发育78。本研究结果表明：颗粒细胞的层数、数量对卵的成熟率和卵裂率影响不大，但能显著提高移植率，与LeibfriedRutledge等9的研究一致。在本评分系统中, 把颗粒细胞的层数、形态及与卵母细胞的关系作为一个较重要的评价指标。通过对颗粒细胞凋亡程度与卵母细胞质量的观察发现, 优质卵母细胞其颗粒细胞凋亡率明显低于非优质卵母细胞。故把颗粒细胞作为卵母细胞质量的一个评价指标是有益的。当然在卵母细胞的评价标准中卵细胞形态始终是最重要的指标，卵细胞形态直接影响卵子的发育潜能10。 目前，临床上使用多种卵母细胞评分标准和胚胎评分标准，且都具有一定的可行性，根据自己的条件，从中选择或自己探索一种简单、省时、高效、可靠的方法来评价卵母细胞的质量具有实用性。因为根据形态学观察作出的判断有一定主观性，所以根据颗粒细胞与卵母细胞的关系，量化颗粒细胞凋亡程度对卵质量和发育潜能的影响，可对形态学判断作有益的补充。探讨改进卵母细胞和胚胎的评价标准，对于提高IVMET治疗不孕不育效率具有重要意义。【参考文献】 1 ZK(#Smitz J, Nogueira D, Cortvrindt R, et al. 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