缺血预处理大鼠心肌细胞中的Bcl-2蛋白对线粒体通透性转.ppt

缺血预处理大鼠心肌细胞中的Bcl 2蛋白对线粒体通透性转换孔的影响 制作者 基础医学0201班第二组 赵金方 吴丹霄 王俐 背景 缺血预处理 IPC 是迄今保护缺血 再灌注 I R 心肌的最强效方式之一 缺血 再灌注损伤致心肌细胞死亡有凋亡和坏死两种形式 IPC心肌保护作用主要表现在缩小心肌梗死面积 线粒体是细胞关键的细胞器之一 它在供能 调节渗透压 钙稳态 PH值以及细胞信号传导中起了重要作用 线粒体通透性转换孔 MPTP 是位于线粒体内外膜间由多个蛋白质组成的复合孔道 又称线粒体大通道 是线粒体内外信息交流的中心枢纽 功能的发挥依赖于其开放状态 根据细胞环境的不同 MPTP可有3种开放状态 一种是完全关闭状态 一种是可逆性的低水平开放状态 另一种是不可逆的高水平开放状态 MPTP高水平开放的直接效应是导致线粒体质子 电化学梯度耗散 离子稳态打破 线粒体肿胀和ATP水解 这些效应最终激发细胞死亡 细胞色素C等凋亡效应因子从线粒体释放是MPTP调控细胞凋亡的关键 Bcl 2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质 在线粒体上 Bcl 2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用 调控线粒体结构与功能的稳定性 发挥着细胞凋亡 主开关 的作用 Bcl 2家族包括两类蛋白质 一类是抗凋亡蛋白 另一类是促凋亡蛋白 平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抗凋亡蛋白成员 如Bcl 2蛋白 则抑制细胞色素C和凋亡诱导因子等促凋亡因子的释放 具有抑制细胞凋亡的功能 由于两者都是通过引起细胞色素C等物质浓度的改变来发挥作用 但是这两者之间是否存在直接联系尚不清楚 本实验旨在于研究Bcl 2蛋白是否会对MPTP的开放情况产生影响 实验设计 将实验动物分为三组 正常对照组缺血再灌组缺血预处理组 比较三者的Bcl 2蛋白的含量和MPTP的开放程度 材料 实验动物 SD大鼠实验药品 戊巴比妥钠 抗鼠Bcl 2抗体及SP免疫组化试剂盒 分离缓冲液A实验仪器 呼吸机 分光光度计 低温高速离心机 方法 1 建立动物缺血模型大鼠用戊巴比妥钠麻醉后 用止血钳游离大鼠左侧的胸大肌 暴露左第2 3 4肋 分别在左第2 3 4肋间隙距离胸骨左缘约0 5cm处进针穿线 每个肋间隙同一进针点穿两根长约40cm的0号手术线 再将两根线用力拉向两侧 分开肋间肌和软组织并结扎肋间动脉 留取结扎线的剩余部分 将两根结扎线剩余部分用力拉向两侧拉开胸腔 并固定之 充分暴露心脏及其表面的血管 剪开心包膜 结扎冠状动脉前降支 结扎之前在预结扎的冠状动脉前降支处放置一根约0 5cm长直径1 5mm的乳胶管 打一个活结结扎 以备进行反复多次缺血再灌实验 2 将实验动物分为三组 正常对照组 穿线但不做结扎处理 持续灌流 缺血再灌组 结扎30min 再灌注20min 缺血预处理组 连续3次停灌3min 复灌5min 然后缺血30min 再灌注20min 3 Bcl 2蛋白含量的测定取心尖以上缺血梗死区横切2mm厚心肌 用免疫组化sp法测定心肌Bcl 2的含量 4 心肌线粒体的制备取左前壁心肌组织 转移至分离缓冲液A中冲洗 剪碎 匀浆 用低温高速离心机分离线粒体 5 MPTP开放程度的检测线粒体蛋白含量的测定 线粒体悬液用考马斯亮蓝法进行蛋白含量测定 以1mg ml的BSA作为标准品 线粒体悬液的吸光度 根据蛋白定量的结果用肿胀液将线粒体混悬液稀释为0 25mg ml 在线粒体悬液中加200 mol ml的CaCl2 测定加入CaCl2前后A520吸光度的变化 每隔30s进行一次 连续观察15min 以到达平衡后的吸光度变化 S作为MPTP开放程度的指标 预期实验结果 Bcl 2蛋