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蛋白免疫印迹技术研究概述摘要：蛋白免疫印迹技术是一种简单的、高效的蛋白免疫检测技术，特别是对蛋白含量低的样品，效果更佳。这种技术的优点是在一个生物样品中使用特定的抗体检测多种蛋白质。蛋白免疫印迹技术已经得到的很大的发展，现在已经出现多种转移方法。至今，蛋白免疫印迹技术已经应用于科研和诊断检测结果检测、在免疫组化中鉴定特定的抗体等领域。关键字：蛋白印记；转印；标记The Overview of Research of Western BlottingAbstract:Despite its overall simplicity,protein blotting or western blotting has be-en proven to be a powerful procedure for the immunodetection of proteins,especially those that are of low abundance.The usefulness of this procedure stems from its abilit- y to provide simultaneous resolution of multiple immunogenic antigens within a sam- ple for detection by specific antibodies.Protein blotting has evolved greatly since its inception and researchers have a variety of ways and means to carry out this transfe- r.This procedure is used to provide confirmation of results both in research and diagnostic testing.Specificity of antibodies used for immunohistochemistry is of critical importance.Key words:western blotting;Transfer printing; mark1 引言 蛋白质印迹技术1（western blotting）中文一般称为，是继DNA印迹（southern blotting）和RNA（northern blotting）之后发展起来的，集电泳、转印和免疫标记为一体的一项蛋白质分离检测技术。它是分子生物学2、生物化学3和免疫遗传学4中常用的一种实验方法。与其他蛋白分离技术相比具有灵敏度高，可达ng级，用Ecl显色法时理论上可达pg级，且操作方便，特异性高5、可进行定性和半定量分析等优点的特点。因此，蛋白印迹技术获得了较好的成果，受到越来越多研究者的青睐。Western Blot实验技术在诸多方面有着广泛的应用，具有良好的应用前景。2 蛋白免疫印迹技术简介 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（George Stark）。在尼尔伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot6。然只有二、三十年的历史，但由于其灵敏度高、操作方便、特异性高、可进行定性和半定量分析等优点的特点，目前，已成功的应用于鉴定蛋白质性质、结构域分析、蛋白质复性、抗体纯化、氨基酸组成分析和序列分析及蛋白质表达水平7等中。 Western Blot由三大部分组成7：SDS-PAGE凝胶电泳将分子量大小不同的蛋白分离开；将蛋白条带转移到固相支持物上；用特异性的抗体检测出固相支持物上的研究对象，也就是相应抗原如图（2.1）。图2.1蛋白印迹操作流程3 蛋白印迹技术步骤 蛋白印迹采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗8。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分，主要步骤如下。 （1）电转移常用的几种印迹法有：点印迹、扩散印迹、溶剂流印迹和电泳印迹。目前，最广泛使用的印迹方法是半干式电转印(电转印也称电转移)，即在电场作用下将凝胶上的蛋白转移到转移液浸湿的膜上。电转印速度快，转移效率离，条件容易控制，重复性好，可保持胶的分辨率。 （2）封闭 蛋白质分子从胶上转移到膜上，为减少探针的非特异结合，用非反应活性分子封阻转移膜上未吸附臻巍质的区域，以降低检测的背景信号。（3）免疫结合反应 用目的缀白的抗体与转移膜上的目的蛋白(靶蛋白)进行特异性免疫结合反应，再用标记过的二抗与膜上的一抗反应。（4）检测 根据连接二抗标识物检出，如：化学发光、显色和放射性同位素测定等，间接检测出网的蛋白的存在。目前常用的的检测方法是化学发光法，即当结合在膜上的HRP标记过的抗体与荧光底物结合，经HRP酶的纯化学氧化产生激发态发光产物。4 蛋白印迹技术原理4.1 SDS凝胶电泳 蛋白印迹与一般的蛋白质分离技术相似，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分离不同分子量的蛋白质。 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关9。其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果10。聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果11。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。PAGE的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应一起可以将不同分子量，不同电荷的蛋白质分离开来。4.2 蛋白印迹转印技术 在PAGE凝胶上的蛋白质需要经过转膜才能被进一步检测，其原理是在电流的作用下，带负电荷的蛋白质从凝胶上解聚，随电流转移到固相载体膜上12。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。常用的膜材料是PVDF膜，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 蛋白免疫印迹法成败的关键是首先必须将分离的蛋白，从非变性或SDS-PAGE凝胶上转印至硝酸纤维素(NC)膜、聚偏乙烯氟化物(PVDF)膜等固相膜上，PVDF膜较NC膜具有更高的蛋白结合性能、物理强度和化学稳定性。转印方法主要有以下两种。4.2.1 简单扩散 此法最初用于等电聚焦电泳凝胶，后被扩展于其他凝胶电泳系统的转印，操作简单，在电泳胶上依次平铺转印膜、滤纸、玻璃片和一定重量的物体，借助重压和扩散将凝胶内分离的蛋白条带印迹到固相膜上13。简单扩散的特点是可在一块胶上转印多张膜14，这也是简单扩散较电转印的优越之处。活化凝胶电泳是一种主要用于检测酶分子(如核酸酶或蛋白酶)的电泳技术。首先，酶分子在含有相应底物(如III型胶原或酪蛋白B)的凝胶中进行非连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用含25Triton X-100的溶液洗去胶中的SDS，使酶复性以催化底物，用考马斯亮蓝(CBB)复染凝胶后便可在蓝色的背景下观测到清晰的被酶分解的底物染色带15。将此法运用到免疫印迹技术中，先将凝胶简单扩散至PVDF膜再按上法对凝胶进行活化胶染色，可同时进行膜免疫印迹反应和凝胶的酶催化反应。图4.1蛋白转印图4.2.2 电转印 电转印主要优点是快速，可靠、转印彻底。电转印又分湿转印和半干转印两种。 (1)湿转印（wet transfer）16,17 将整个夹心式转印体系(支持垫-滤纸-转印膜一凝胶-滤纸-支持垫)垂直地直接浸入缓冲液内进行转印。其装置多采用Towbin设计的垂直式不锈钢/铂电极转印槽。 (2)半干转印(semi-dry transfer)16,17 所谓半干转印或水平式转印，是事先将转印体系中的凝胶、膜、滤纸及支持垫浸泡在转移缓冲液中，浸湿片刻后直接进行转印，而无须将其浸入缓冲液内。半干转印优于垂直转印，因为水平转印仪一次可以转印多块胶，而且所需电压较低。4.3 蛋白免疫印迹检测 转印在膜上的蛋白抗原虽可直接用有机染料染色，但主要还是采用基于抗原-抗体反应原理的免疫学检测。根据抗体标记物不同，可分为以下几种方法。4.3.1 同位素标记技术 将125I标记葡萄球菌A蛋白或G蛋白(SPA、SPG)或其他二抗，与结合在膜上的抗原一抗体(一抗)复合物发生反应，通过检测放射性同位素活性来验证相应抗原的特异性18,19。放射性标记有两个优点，一是显色条带通过闪烁计数仪可以进行定量分析，二是重复性较好18,19。4.3.2 非同位素标记技术 (1)酶标记20 酶标记法的优点是简便，不需特殊仪器设备，不足是不易精确定量分析，而且膜上非特异性反应较强，使结果难以判断和分析。随着酶化学发光分析技术的问世和发展，酶标记免疫印迹技术得到了更加广泛而有效地应用。 (2)化学发光标记 化学发光不像荧光和磷光那样需要激发光源，仅需一个单色光检测仪。化学发光虽不如激发光谱学应用广泛，但其检测极限却比其他发光技术要低10100倍。大部分化学发光技术均需采用化学发光物质，应用得较多的是鲁米诺21。当结合在膜上的HRP或AKP标记的抗体与荧光底物发生结合后，底物经酶的化学氧化产生激发态产物，后者随即发出光信号。例如，HRP在过氧化氢存在下，能催化鲁米诺氧化使其进入激发态，进而衰变而发光。膜上抗原一抗体特异性反应条带可通过曝光系统在x光胶片上得到显影，曝光时间通常不到1min。该法的检测敏感性可达lpg。化学发光法的另一个优势之处是，可以在同一张膜上分别检测不同的抗原。其做法是，当一次曝光检测结束后，用抗体去除液(pH6.7，20g/LSDS，100mmoL/L，2-巯基乙醇，62.5mmol/LTris-HCl)除去转印膜上已结合的抗体，按常法洗涤、封闭后，加另外一种一抗和酶标二抗，进行再次曝光，显色。用同法可在同张膜上进行多次抗体结合和检测。特别适合于检测细胞裂解液中相应蛋白的表达情况。目前化学发光检测已有成套试剂盒供应(ECLTM蛋白免疫印迹detection reagents，Amersham Pharmaeia Biotech)，大大简化了实验操作。Krajewski等22建立了一种多重抗原检测(MAD)法旧，可在不需去除抗体的前提下在同一张膜上相继检测多种抗原。具体方法是，第一种抗原一抗体-酶标二抗发光底物相继反应后，经过曝光系统将转印膜显色带转移至X光胶片上，保留转印膜，使膜上的抗原抗体复合物与底物(如DAB)发生反应，以终止HRP活性，这样抗原一抗体酶复合物便不能与随后加入的第二种抗体系统发生反应。按此法操作，能在同张膜上相继使用至少12种不同的抗体。 (3)金标记 标记也可用于检测转印膜上的抗原抗体复合物，其敏感性为1050ng，显色带呈红色。当用银染液复染后，显色带变为黑色，抗原检测敏感性可达110ng，接近同位素标记法23。 (4)荧光素标记荧光素 尼罗红(Nile red)可对SDS-PAGE凝胶上的蛋白条带进行染色，被染凝胶可直接转印至PVDF膜，这是考马斯亮蓝和银染法所不具有的特性。转印在PVDF膜上的蛋白条带随即可用荧光素2-甲氧-2，4二苯基呋喃(MDPF)进行染色，染色后的PVDF膜可进一步做免疫标记以检测特异性抗原。此法可使凝胶上蛋白带染色、转印膜上蛋白带显色以及膜上特异性蛋白的免疫标记检测在一次蛋白免疫印迹中同时进行24。 最近，有学者应用荧光素藻胆素(异藻蓝蛋白)标记抗鼠IsG建立敏感的荧光检测技术检测尼龙膜上结合的鼠IgG。其敏感性高于酶放大反应和化学发光标记技术。由于去除了底物反应、X光胶片曝光时间，因而比化学发光法缩短了操作时间25。为进一步缩短二抗反应和底物显色时间，最近Bergendahlpl26等建立了一种直接荧光素标记技术，利用荧光素的琥珀酰亚胺基团能选择性地与抗体分子中的赖氨酸残基发生结合的原理，将强荧光团染料青色素(cyanine dye)IC5直接标记在一抗，当蛋白经SDSPAGE电泳、转印及封闭后，直接将膜浸入1C5标记的一抗，室温反应560min，PBS洗涤后即可用荧光检测仪在红荧光扫描模式中进行测定。此法从电泳、转印、到免疫检测，仅需3h，而普通化学发光标记法往往需要12d时间。5 结语 蛋白分离技术正在持续发展，而且不断涌现出多种转移检测蛋白质的方法。因为是通过特定的蛋白抗体检测，所以此种蛋白分离技术可以解决一种蛋白样品中多种蛋白的检测。这使得Western Blot技术在蛋白分离方面非凡的价值，特别是在免疫组化方面的检测特定的蛋白意义深远。参 考 文 献：1武建国.实用临床免疫学检验M.南京:江苏科学技术出版社，1990.67-70.2于爽,王蕾,耿秋娜,等.牛血红蛋白印迹聚合物研究J.2008-2008年全国生物医药色谱交流 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