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维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM3凋亡作用的影响来源：医学论文发表创新医学网/ 作者：朱云鸿， 徐瑞容 黄红铭， 丁润生， 陆 伟 作者单位：南通大学附属医院血液科， 南通 226001【摘要】 目的：为了研究维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤细胞株KM-3细胞凋亡效应的影响。方法：采用细胞计数法检测硼替佐米15 nmol/L+10、20、40、80 mol/L维生素C处理KM-3细胞生长抑制率，用流式细胞术分析Annexin-V/PI、线粒体跨膜电位(m)和氧自由基(ROS)，用分光光度法检测Caspase3活性。结果：硼替佐米对KM-3细胞增殖抑制作用降低，24 hAnnexin-V阳性细胞比例下降，m降低被阻止，18 h活性氧水平下降，16 h Caspase-3活性下降。结论：维生素C对硼替佐米诱导KM-3细胞凋亡效应具有抑制作用。【关键词】 多发性骨髓瘤;维生素C;硼替佐米;凋亡;活性氧Effect of Vitamin C on Bortezomib-induced apoptotic death in multiple myeloma cell line KM-3ZHU Yunhong，XU Ruirong，HUANG Hongming，et al (Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001)Abstract Objective: To investigate the effect of Vitamin C on multiple myeloma cell line KM-3 apoptosis induced by Bortezomib. Methods: Cell viability inhibition ratio was estimated by counting method. Annexin-V，mitochondrial transmembrane potential(m) and reactive oxygen species(ROS) labeled by DCFHDA were examined by flow cytometry， and the activity of Caspase-3 was detected by spectrophotometry. Results: The inhibition of Bortezomib on the multiple myeloma cell line KM-3 proliferationwas decreased， the ratio of Annexin-V positive cells at the 24th hour declined， the decrease of m was prevented， the level of ROS at the 18th hour dropped， and the activity of Caspase-3 at the 16th hour declined. Conclusion: Vitamin C may abrogate the ability of Bortezomib to induce apoptosis on multiple myeloma cell line KM-3.Key words Multiple myeloma;Vitamin C;Bortezomib;Apoptosis;Reactive oxygen蛋白酶体抑制剂是近年来发现的一种靶向治疗肿瘤的药物。在真核细胞中80%以上蛋白降解是通过蛋白酶体介导的，蛋白酶体抑制剂通过对蛋白酶体的抑制剂发挥抗肿瘤作用1。硼替佐米是一种高选择性，可逆的26S蛋白酶体抑制剂，是第1个进入临床的该类药物。目前认为硼替佐米的主要作用机制是抑制I-B在蛋白酶体内降解，使NF-B停留在细胞质内，功能受抑制，失去抗凋亡效应和刺激细胞增生作用1-2。维生素C是一种多羟基化合物有清除氧自由基，抗氧化作用3。研究显示维生素C能增强三氧化二砷对高发性骨髓瘤(MM)疗效4。本实验探讨抗氧化剂维生素C对硼替佐米诱导多发性骨髓瘤KM-3细胞株凋亡的影响。1 材料和方法1.1 细胞培养 多发性骨髓瘤细胞株KM-3(由上海长征医院血液科侯健教授惠赠)置于含10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司产品)的RPMI1640培养液(Gibco公司产品)中，于37 、5%CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以1105细胞/ml的密度接种培养。1.2 WST-1法检测生长抑制率 WST-1(碧云天生物技术研究所产品)在电子耦合剂存在的情况下，被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深;细胞毒性越大，则颜色越浅。在450 nm处有吸收峰，生长抑制率如下公式计算：细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)100%1.3 形态学观察 细胞收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。1.4 Annexin-V分析 使用FITC标记的Annexin-V和PI双染法检测细胞凋亡，根据晶美生物工程有限公司提供的说明书进行操作。即取(510)万个细胞，经4 PBS漂洗2次，弃上清，加入250 l Annexin V-FITC结合液重悬细胞。取100 l移入流式细胞仪专用试管，加入5 l Annexin V-FITC、10 l碘化丙啶染色液轻轻混匀。室温(2025 )避光孵育15分钟。加入400 l PBS轻轻混匀，用流式细胞仪进行分析。1.5 线粒体跨膜电位(m)检测 JC-1(碧云天生物生物技术研究所产品)在线粒体膜电位较高时聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光。用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。取(1060)万细胞，重悬于0.5 ml细胞培养液中，加入0.5 ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37 孵育20分钟。600 g 4 离心34分钟，沉淀细胞，弃上清，用冰浴的JC-1染色缓冲液洗涤2次，再用0.4 ml JC-1染色缓冲液重悬后，用流式细胞仪分析。1.6 Caspase 3活性检测 Caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405 nm附近有强吸收，通过测定pNA吸光度来检测Caspase 3的活性。根据碧云天生物生物技术研究所产品说明操作。600 g 4 离心5分钟收集细胞， PBS洗涤1次。取200万细胞加入100 l裂解液，冰浴裂解15分钟。4 16 00020 000 g离心1015分钟，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。取出10 l加入反应体系37 温育出现变色后，于405 nm测吸光度。对照标准曲线确定pNA量。1.7 活性氧检测 DCFHDA(碧云天生物生物技术研究所产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化生成DCFH，DCFH不能通透细胞膜，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF的激发波长为488 nm，吸收波长为525 nm。收集一百万细胞悬浮于15 000无血清培养液稀释的1 ml DCFH-DA中，37 细胞培养箱内孵育20分钟。用PBS洗涤细胞3次，加入200 l PBS，用流式细胞仪检测一万个细胞。2 结 果2.1 硼替佐米、硼替佐米+维生素C对KM-3细胞的抑制作用 KM-3细胞经10、25、50、75 nmol/L浓度的硼替佐米处理24 h后生长抑制率的3次均值分别为40.83%、44.9%、51.2%和55.17%，48 h分别为45.9%、58.7%、71.2%和78.1%。根据48 h半数抑制浓度选择药物作用浓度，因此选择硼替佐米15 nmol /L 作为药物处理浓度。再将KM-3细胞经硼替佐米15 nmol/L+维生素C 10、20、40、80 mol/L作用24、48 h计算细胞生长抑制率3次均值分别为23.65%、11.1%、7.53%、4.3%;20.3%、9.8%、6.36%、3.40%(图1)。选择80 mol/L作为维生素C处理浓度。2.2 维生素C对硼替佐米诱导KM-3细胞凋亡作用的影响2.2.1 细胞形态学改变 收集细胞涂片，瑞氏染色后光学显微镜下观察对照组和维生素C组细胞形态正常(图2A、2B)。硼替佐米+维生素C处理组细胞形态正常，偶见凋亡细胞(图2C)。硼替佐米处理组可见胞膜皱缩、染色质凝集、边缘化、胞质起泡(图2D)。2.2.2 Annexin V 分析 24 hAnnexin V FITC / PI双标结果显示，硼替佐米处理组凋亡细胞比例重复3次为(16.31.95)%(图3A)，硼替佐米+维生素C组为(8.460.89)%(图3B)，低于硼替佐米处理组(P0.01)。对照组为(5.411.3)%(图3C)。维生素C组为(4.91.4)%(图3D)。2.2.3 线粒体跨膜电位变化 硼替佐米处理组24 h后M检测显示M降低，绿色荧光细胞比率重复3次为(11.321.86)%(图4A)，高于硼替佐米+维生素C处理组(5.10.91)%(P0.01)(图4B)。对照组为(4.60.98)%(图4C)。维生素C组为3.60.84%(图4D)。2.2.4 Caspase-3 活性 硼替佐米处理组16 h后3个平行组产生的pNA为25.210.349 mol。 硼替佐米+维生素C处理组为21.790.198 mol，低于硼替佐米组(P0.01)。对照组为20.670.156 mol，维生素C组为20.120.17 mol。2.2.5 活性氧水平变化 18 h后平均荧光强度硼替佐米+维生素C处理组为30.21.96(图5A)低于硼替佐米处理组为52.231.9(图5B)(P0.01);对照组为28.41.87(图5C);维生素C组为21.31.6(图5D)低于对照组(P20 mmol/L)对细胞有杀伤作用8。本实验中Annexin V/PI分析显示加入维生素C后，细胞早期凋亡率明显下降。硼替佐米处理24 h后细胞呈典型凋亡改变，加入维生素C后细胞形态大体正常。所以认为维生素C在较低浓度(80 mol/L)下有抑制硼替佐米对KM-3凋亡的诱导作用。诱导细胞凋亡有3种信号通路： 死亡受体信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路， 目前认为线粒体途径在凋亡过程发挥枢纽作用9。氧化刺激、Ca2+过量摄取等诱导因素导致的细胞凋亡，都有线粒体跨膜电位消失。因而线粒体跨膜电位的消失标志着一个不可逆转的凋亡过程。实验中发现加入维生素C后线粒体膜电位崩溃的绿色荧光细胞比率较硼替佐米处理组显著降低。Caspase蛋白酶家族是引起细胞凋亡的关键酶，实验显示KM-3细胞经硼替佐米作用16 h后pNA产生增加Caspase-3活性较对照升高，加入维生素C后pNA产生减少，酶活性下降。正常情况下NF-B是一种核转录因子，在细胞质中与抑制剂I-B相互作用形成复合体，防止NF-B进入核内，NF-B介导的转录作用被阻断;一旦I-B磷酸化与NF-B解离，NF-B进入核内诱导抗凋亡蛋白的合成，细胞增生并表达黏附分子导致细胞增生、存活;而在MM瘤细胞中NF-B组成性激活，导致瘤细胞不断增生。如果I-B在蛋白酶体内降解受抑制，NF-B停留在细胞质内，功能受抑制，失去抗凋亡效应和刺激细胞增生作用10-11。目前认为这是硼替佐米的主要作用机制，但硼替佐米并不仅仅通过抑制该通路发挥作用，还存在其他作用机制。活性氧是细胞凋亡的信号之一，活性氧的产生可直接或间接改变线粒体膜电位，促进CytC从线粒体内释放，启动线粒体信号通路12。陈丽娟等13研究发现硼替佐米可改变多发性骨髓瘤U266细胞株内氧化还原状态，导致线粒体和内质网产生活性氧增多，从而诱导U266细胞凋亡。由此推测，线粒体途径参与了硼替佐米诱导的多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡。实验中用DCFHDA作为荧光探针测定细胞内活性氧水平时，发现维生素C降低了硼替佐米产生的活性氧水平，降低了无诱导因素作用的对照组细胞活性氧水平。因而认为维生素C能清除胞内活性氧，正是该作用降低硼替佐米诱发的活性氧水平，阻止了线粒体膜电位的崩溃。本实验探讨了维生素C在体外环境、低浓度下对硼替佐米作用影响，至于高浓度及体内条件下的作用需进一步研究。【参考文献】1 Hideshima T，Chauhan D，Richardson P，et al.NF-kappa B as a therapeutic target in multiple myelomaJ. J Biol Chem， 2002，277(19):16639-16647.2 Hideshima T，Mitsiades C，Akiyama M，et al.Molecular冠心病病人血清脂联素和补体激活产物浓度的变化来源：医学论文发表创新医学网/作者：王元松1,王红巧2，朱京伟3,刘成玉4 作者单位：(青岛大学医学院,山东 青岛 266071 1 临床技能学实验室; 2 青岛市海慈医疗集团; 3 附属烟台毓璜顶医院检验科; 4 诊断学教研室)【摘要】 目的 探讨冠心病(CHD)病人血清脂联素(APN)与补体激活产物浓度的变化和意义。方法 采用ELISA法检测96例CHD病人血清APN和可溶性补体激活产物(sC5b9)的变化，其中急性心肌梗死(AMI)20例，陈旧性心肌梗死(OMI)24例，不稳定型心绞痛(UAP)28例，稳定型心绞痛(SAP)24例，并以36例健康人检测结果作为对照。结果 CHD病人血清APN浓度显著低于对照组，sC5b9浓度明显高于对照组(t=5.624、6.448，P0.01);不同类型CHD病人APN和sC5b9浓度差异有显著性(F=56.258、69.724，q=5.66511.259，P0.01)。有并发症的CHD病人血清APN浓度明显低于无并发症病人，sC5b9浓度明显高于无并发症病人，差异有显著性(t=6.934、6.455，P0.01)。CHD病人血清APN与sC5b9浓度呈负相关(r=-0.548，P0.01);SAP组、UAP组和AMI组血清APN与sC5b9浓度呈负相关(r=-0.513-0.625，P0.05、0.01)。结论 APN 和sC5b9参与了冠心病的发生与发展，且与病情严重程度有关。【关键词】 冠状动脉疾病;脂联素;补体;酶联免疫吸附测定CHANGES OF ADIPONECTIN AND COMPLEMENT ACTIVATION COMPONENT IN PATIENTS WITH CORONARY HEART DISEASE WANG YUANSONG, WANG HONGQIAO, ZHU JINGWEI, et al (Lab of Clinical Skills, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China); ABSTRACT Objective To explore the changes and significance of serum adiponectin (APN) and complement activation component (sC5b9) in patients with coronary heart disease (CHD). Methods By means of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the serum APN and sC5b9 in 96 patients with CHD were detected, of which, 20 patients were suffering from acute myocardial infarction (AMI), 24 from olden myocardial infarction (OMI), 28 with unstable angina (UAP), and 24 patients with stable angina (SAP). The findings were compared with 36 healthy subjects. Results Serum concentration of APN was significantly lower, and that of sC5b9 was significantly higher in patients with CHD than those in the control (t=5.624,6.448;P0.01). The levels of serum APN and sC5b9 among the diferent types of CHD were different (F=56.258,69.724;q=5.665-11.259;P0.01). Serum concentration of APN was significantly lower, and sC5b9 higher in CHD patients with complications than those without complications (t=6.934,6.455;P0.01).There was a negative correlation between APN and sC5b9 in patients with CHD (r=-0.548,P0.01),APN correlated negatively with sC5b9 in SAP, UAP and AMI groups (r=-0.513-0.625,P0.05,0.01). Conclusion APN and sC5b9 involve in the onset and development of CHD, and relate to the state of the illness.KEY WORDS coronary artery disease; adiponectin; atherosclerosis; enzymelinked immunosorbent assay脂联素(APN)是由脂肪细胞分泌的一种胶原样血浆激素蛋白。KUMI等1研究表明，APN不仅与肥胖、2型糖尿病和胰岛素抵抗有关，而且还具有抗炎、抗动脉粥样硬化(AS)的作用。吴素华等2研究结果表明，补体参与了动脉粥样硬化的发生与发展，补体激活是心肌缺血损伤的一种急性反应，而且不稳定型心绞痛(UAP)病人血清可溶性补体激活产物(sC5b9)明显增高3。为了进一步研究APN与补体激活在冠心病(CHD)发病中的作用，本文检测了96例CHD病人血清APN和sC5b9浓度变化，并探讨二者之间的关系，现将结果报告如下。1 资料与方法1.1 对象及分组2007年8月2008年5月，选择经冠状动脉造影证实为CHD的病人96例，男50例，女46例;年龄5172岁，平均(60.412.5)岁。据国际心脏协会WHO临床命名及诊断标准分为4组：急性心肌梗死(AMI)20例，男10例，女10例，年龄(66.712.8)岁;陈旧性心肌梗死(OMI)24例，男12例，女12例，年龄(63.39.7)岁;不稳定型心绞痛(UAP)28例，男16例，女12例，年龄(62.611.8)岁;稳定型心绞痛(SAP)24例，男12例，女12例，年龄(62.511.8)岁。96例病人中，并发高血压者21例，糖尿病者15例，并发高血压、糖尿病者9例。所有病人均排除免疫性疾病和近期感染。选健康体检者36例作为对照组，男20例，女16例，年龄5370岁，平均(61.68.1)岁，均为无心、脑、肝、肾、内分泌及血液系统疾病。1.2 APN和sC5b9检测方法对照组和CHD病人均于清晨采集空腹肘静脉血5 mL，室温静置30 min，3 000 r/min离心分离血清，于-20 冰箱保存。APN测定采用ELISA方法，试剂盒购自美国TPI试剂公司，严格按照说明书操作。sC5b9测定采用ELISA法，试剂盒由丹麦DaKo公司提供。1.3 统计学处理采用PPMS 1.54统计软件进行数据处理，结果以s表示。数据间比较采用t检验和方差分析，相关关系采用直线相关分析。2 结 果2.1 不同类型CHD病人血清APN和sC5b9浓度比较CHD病人的血清APN浓度明显低于对照组，sC5b9浓度明显高于对照组，差异有显著意义(t=5.624、6.448，P0.01)。不同类型CHD病人血清APN和sC5b9浓度相比较差异也有显著意义(F=56.258、69.724，q=5.66511.259，P0.01)。见表1。有并发症的CHD病人血清APN浓度明显低于无并发症病人，sC5b9浓度明显高于无并发症病人，差异有显著意义(t=6.934、6.455，P0.01)。见表2。2.2 血清APN与sC5b9的相关性CHD病人血清APN与sC5b9浓度之间呈负相关(r=-0.548，P0.01);SAP组、UAP组和AMI组病人血清APN与sC5b9浓度之间也均呈负相关(r=-0.513-0.625，P0.50; *与*比较,2=28.034，P0.50;*与*比较,2=11.159，P0.50)，男性ABO HDN患者的构成比与女性ABO HDN患者的构成比比较差异有显著性(P0.50)，A型ABO HDN患者的构成比与B型ABO HDN患者的构成比比较差异有显著性(P0.005)，B型ABO HDN患者比A型ABO HDN患者多.在本组检出的ABO HDN患者中，有部分患者的DAT阴性或热放散试验阴性,对此笔者认为是由于患者红细胞上结合的病理性IgG抗A(B)量较少所致;有部分患者的IAT阴性,对此笔者认为是由于患者血液中游离的病理性IgG抗A(B)量较少所致。ABO HDN多发于O型母亲所生的A型或B型新生儿1,4。由于ABO HDN的发病率较高,因此医务工作者应高度重视。ABO HDN的病情进展速度较快，易形成核黄疸，故在确诊后应立即采取适当的光疗、药疗及输血治疗，这是预防核黄疸形成的重要措施。就输血治疗而言，通常主张换血治疗，其目的主要是清除ABO HDN患者体内过高的未结合胆红素、游离的病理性IgG抗A(B)及其致敏红细胞，以降低未结合胆红素、减轻溶血及纠正贫血，因此换血治疗对预防核黄疸的形成及促进患儿康复相当有益5。诊断ABO HDN应在新生儿出现黄疸症状时就抽血样检查，笔者认为最迟不超过3天,这样发生漏检而误诊的可能性较小，若在3天后才抽血样检查,则发生漏检而误诊的可能性较大。本组病例,有部分在3天后才抽血样检查,可能有一些ABO HDN患者漏检。【参考文献】1 刘达庄.免疫血液学.上海:上海科技出版社,2002，128-137.2 肖星甫等译.输血技术手册.北京:人民卫生出版社,1985，280-330.3 中华人民共和国卫生部.中国输血技术规程(血站部分).天津：天津科学技术出版社,1997，40-120.4 金汉珍，樊绍曾.新生儿母婴血型不合溶血病.上海:上海科学技术出版社,1981，120-130.5 Walker RH.Technical Manual,12th ed.Alington:AABB,1997.老年冠心病患者血清脂联素及肺炎衣原体抗体等水平的观察来源：医学论文发表创新医学网/作者：刘俊恒 倪黎刚 史恒川 作者单位：210024江苏省南京市，江苏省省级机关医院检验科【摘要】 目的 探讨老年冠心病(CHD) 患者血清脂联素、肺炎衣原体(Cpn)抗体及细胞间黏附分子1 (ICAM1)等水平的变化及其临床意义。 方法 临床确诊的老年CHD病人300例，以342例健康查体者为对照组，放免法测定其血清脂联素，ELISA法检测血清Cpn抗体及ICAM1、C反应蛋白(CRP)、白介素6(IL6)水平，同时对其作血脂分析。 结果 老年CHD患者血清Cpn IgA抗体阳性率显著高于对照组(P0.01)，IgM抗体则与对照组无显著差异;急性心肌梗死(AMI)及不稳定型心绞痛(UAP)者Cpn IgG抗体阳性率明显高于对照组(P0.05)。CHD病人血清脂联素明显低于对照组(P0.01)，而ICAM1、CRP及IL6则明显高于对照组(P0.05)。 结论 Cpn抗体高阳性率及脂联素的降低与老年冠心病之间存在联系,而患者血清ICAM1、CRP及IL6水平的升高也提示炎症反应在冠心病的发生发展中起着重要作用。【关键词】 冠心病; 脂联素; 肺炎衣原体; 黏附分子Serum adiponectin and chlamydia pneumonia antibody determination in elderly patients with coronary heart disease LIU Junheng, NI Ligang, SHI Hengchuan.Department of Clinical Laboratory, Jiangsu Province Official Hospital, Nanjing 210024, China【Abstract】Objective To determine serum adiponectin, chlamydia pneumonia(Cpn) antibody and intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) levels in elderly patients with coronary heart disease(CHD), and to find its clinical significance. Methods Serum adiponectin, Cpn antibody, ICAM1, C reactive protein(CRP) and interleukin6(IL6) were determined by RIA or ELISA in 300 CHD patients and 342 normal subjects. The blood lipid level was also measured at the same time. Results The positive rate of Cpn IgA antibody in elderly CHD patients was significantly higher than that in normal people(P0.01), but there was no difference in IgM antibody. The positive rate of Cpn IgG antibody in patients with acute myocardial infarction(AMI) or unstable angina pectoris(UAP) was also significantly higher than that in normal people(P0.05). Serum adiponectin in CHD patients was lower than that in normal people. The levels of ICAM1, CRP and IL6 were significantly higher in CHD patients than those in normal people(P0.05). Conclusions There is an relationship between elderly CHD and high p