SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子量的测定摘要：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二万基硫酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的Mr，而与所带电荷无关。在一定条件下，蛋白质的Mr与电泳迁移率的关系可表示为：lgMr=lgK-bm=K1-bm.式中MR为蛋白质的相对分子质量，K,K1为常数，b为斜率，m为迁移率。据此，我们在实验后，根据蛋白质在凝胶上所形成的跑带，算出蛋白质的迁移率，就可以算出蛋白质分子量。关键词：聚丙烯酰胺凝胶，电泳，染色，脱色 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis）,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲液，PH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量.1、实验材料和试验方法1.1实验仪器：垂直板型电泳槽、DYY2C型电泳仪:直流稳压电源，电流100mA，电压400500V、吹风机、电子分析天平、微量注射器、培养皿、药匙、称量纸、50ml烧杯3只、1000ml烧杯2只、胶头滴管、量筒、离心管、1000ml容量瓶3只、1ml移液管3只、水浴锅、玻璃棒、抽滤机、洗瓶、电炉1.2实验试剂：1、标准蛋白质（纯品）标准蛋白质来源Mr细胞色素C胰凝乳蛋白酶原A胃蛋白酶卵清蛋白牛血清清蛋白马心牛胰猪胃鸡卵牛血清12500250003500043000670002、0.2mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液：取280ml0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，如入720ml0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后在PH计上调至PH7.2此溶液用来进一步配制凝胶缓冲液、电极缓冲液和样品溶解液。3、样品溶解液：0.01mol/L,PH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS，1%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法如下：SDS100mg巯基乙醇0.1ml甘油1ml溴酚蓝2mg0.2mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液0.5ml加蒸馏水至总体积10ml4、电极缓冲液：0.1%SDS，0.1mol/LPH，7.2磷酸盐缓冲液（或TrisHCL缓冲液）：取1gSDS，加入500ml0.2mol/L，PH7.2磷酸盐缓冲液，用蒸馏水定容至1000ml5、染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入454ml50%甲醇和46ml冰乙酸6、脱色液：75ml冰乙酸，875ml蒸馏水与50ml甲醇混合7、SDS：市售化学纯SDS需重结晶后使用。重结晶方法如下：称取20gSDS，放入500ml圆底烧瓶中，加约半牛角匙活性炭及300ml无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热至乙醇微沸，回流约10分钟，用热过滤漏斗乘热过滤。滤液应透明无色。滤液冷至室温后，移至20度冰箱中过夜。次日，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量20度午睡乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥或40度一下烘箱中烘干。1.3实验方法：(一) 、贮液及凝胶的配制贮液20ml凝胶溶液混合比5%凝胶10%凝胶1凝胶贮液Acr 30gBis 0.8g加蒸馏水到100ml3.33ml6.67ml2凝胶缓冲液SDS 0.2g加0.2mol/L,PH7.2磷酸盐缓冲液至100ml或加0.2mol/L,PH7.2TrisHCL缓冲液至100ml10ml10ml31%TEMEDTEMED 1ml加蒸馏水至100ml2ml2ml蒸馏水4.57ml1.23ml以上溶液混合后抽气10分钟410%过硫酸铵过硫酸铵 1g加蒸馏水至 10ml0.1ml0.1ml(二) 、样品的制备一般是将蛋白质溶解在含1%SDS、1%巯基乙醇的0.01mol/L，PH7.2的磷酸盐缓冲液中，在100度加热25分钟。蛋白质的最后浓度一般为0.05mg1mg/ml也可以将上述溶液在37度保温2小时而不是100度加热。一般说来，两种处理的效果都一样。但如蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37度处理就会引起样品水解，使测定失败，而100度加热3分钟一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需要采用特殊的样品处理方法。（三）、标准蛋白质样品的制备称取细胞色素C。胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋白、牛血亲风格清蛋白各0.2mg左右，分别放入小试管中，按0.5mg蛋白质/1ml溶液的比例，向样品中加入“样品溶解液”，使充分溶解，轻轻盖上软木塞（不要塞紧，以免加热时迸出），将小试管放入沸水浴中加热3分钟，取出冷至室温。（四）、待测蛋白质样品的制备固体样品的制备与标准蛋白质相同如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高一倍），将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同时加热。若待测溶液太稀可事先浓缩；若溶液含盐量太高则需先进行透析。处理好的样品溶液即可用于电泳。每个凝胶样品孔内加5微克蛋白质便可得到清晰的区带处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长时间，使用前在100度水浴中加热1分钟，以除去可能出现的亚稳态聚合物。（五）、电泳将聚合好的凝胶连同制胶膜具装置在电泳槽上，拔掉样品槽模板（梳子），用电极缓冲液清洗样品孔，然后将上下电极槽注满电极缓冲液，检查上槽无泄漏，即可加样。用微量注射器按号向凝胶样品孔内加样，每孔加20微升（含蛋白质15微克），稀的样品可适量增加其体积。加样完毕，打开直流稳压电源（负极接上槽，正极接下槽，事先接好），将电流调至25mA10分钟，后在调至70mA，保持电流强度不变，待染料（染料已事先加在“样品溶解液”中）迁移至距凝胶下端约1cm处，停止电泳（六）、染色、脱色将凝胶片取出，滑入一白瓷盘或大培养皿内，在染料区带的中心插入细铜丝作为标志。加入染色液，染色1小时左右。倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换液一次，直至背景清晰。（七）、Mr的计算通常以相对迁移率Mr来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算： 以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。2、实验结果与分析实验所得实际图片如下：根据现场测量，得样品蛋白的平均迁移距离a为1.8cm,染料迁移距离为4.2cm.据此可得所测蛋白质的迁移率:R=ab=1.84.2=0.43。以此数据同标准蛋白的跑带相比，可知所测蛋白质的分子量在25KD到35KD之间。3、讨论 本次实验结果不太理想，从蛋白质的跑带可以看出，跑带是参差不起的，并且还左右弯曲。实验结果中蛋白质的迁移距离取的是八组数据的平均值，而染料迁移距离取的是较为平直一