WesternBlotting.doc

Western Blotting虞峰09.6.5一、试剂配制1.基础试剂10% SDS 10g SDS加双蒸水溶解，定容至100mL，室温保存1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 12.12g Tris，用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水至100mL，灭菌后4保存1.0mol/L Tris-HCl（pH7.5） 12.12g Tris，加双蒸水至80-90mL, 用浓HCl调pH至7.5，加双蒸水至100mL，灭菌后4保存1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8) 18.16g Tris, 加双蒸水至80-90mL，用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水水至100mL，灭菌后4保存0.25mol/L EDTA(pH8.0) 9.31g EDTA，加80-90mL双蒸水溶解，,用固体NaOH调pH至8.0 ，定容至100mL30%Acr-Bis mixture 29g Accylamide, 1g Bis-acrtamide, 加双蒸水溶解，定容至100mL，4避光冷藏10%AP 0.6g过硫酸铵，加双蒸水溶解，定容至6mL，分装160L/管，-20冷冻保存2. BuffersLysis buffer1mol/L Tris HCl(pH7.5) 5mL (50mmol/L)0.1mol/L EDTA 5mL (5mmol/L)TritonX-100 1mL (1% V/V)NaCl 0.8775gAdd DD water Up to 100mL6X Loading Buffer配法：不含DTT的Loading BufferTirs HCl(pH8.0) 25mL甘油 100mL10%SDS 80mL溴酚蓝 0.080g取10mL不含DTT的Loading Buffer,加入0.540gDTT，溶解后分装，保存在-2010X Running Buffer Tris 36.2g甘氨酸 144gSDS 10g加双蒸水至1L10X TBSTris 24.2gNaCl 80g加双蒸水至1LTBST10x TBS 100mLTween-20 1mL加双蒸水至900mL，调pH=7.4, 加双蒸水定容至1L1X Trans Buffer（半干转膜用）Tris-base 5.82g甘氨酸Glycine 2.93gSDS 0.375g甲醇 200mL加双蒸水至1L也可配制时不加甲醇,临用时再添加.如果配制的是含有甲醇的溶液，必须用密封容器盛装，以免甲醇挥发10X Trans Buffer （湿法转膜用）甘氨酸144gTris 33.3g加双蒸水定容至1L1X Trans Buffer （湿法转膜用）用双蒸水把10X的Trans Buffer （湿法转膜用）稀释到1X的浓度。置于0度或4度冰箱备用。3. Gels分离胶 10mL6%8%8%10%12%H2O5.33.454.64.03.330% Acr-Bis2.01.952.73.34.01.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.51.952.52.52.510% SDS0.10.0750.10.10.110% 过硫酸铵0.10.0750.10.10.1TEMED0.0080.00450.0060.0060.006浓缩胶 3mL5%H2O2.130% Acr Bis mix0.51.0mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.3810% SDS0.0310% 过硫酸铵0.03TEMED0.003*以上单位都是mL*可分离的目标蛋白分子量(kD)范围凝胶浓度4-2020%12-4515%10-7012.5%15-10010%25-2008%常用内参分子量(kD)-actin43GAPDH30-40(43)Tubulin55实验室的电泳槽浓缩胶电压/V分离胶电压/VHoeffer69.6130.5BioRed58.4109.5蛋白提取A. 贴壁细胞1.用3mL PBS洗一下细胞2.倒干PBS（尽量干），加入100L Lysis Buffer（每106细胞约60L）。六孔板则每孔75L3.冰上放置30-45分钟4. 4 12000g，5min，取上清，注意不要吸到沉淀5.应当在2小时内用蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，6.按测出的浓度，取100-500g, 用Lysis buffer稀释，按比例加入Loading Buffer后沸水浴3min7.保存在-20B. 组织1.剪取适量组织，称重，按每1g组织加入4mL Lysis Buffer和50L Cocktail蛋白酶抑制剂2.加液氮，在研钵中研碎，或是用移液枪打碎3.冰上放置30-45min4. 4 12000g，2min，取上清，注意不要吸到沉淀5.保存在-70（-20短期保存）6.用蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，7.按测出的浓度，取100-200g, 用Lysis buffer稀释，按比例加入Loading Buffer后沸水浴5min8.保存在-20制胶1.选取所需厚度玻璃板，洗净2.在胶架上夹紧两块玻璃板，加水检漏10min3.倒干水，配制分离胶，沿玻璃板的一侧加入玻璃板缝隙中，缓缓加1mL异丙醇封液面，室温静置20min（夏天）-1h（冬天），待分离胶凝固4.倒干异丙醇，配制堆积胶液，沿一侧加入玻璃板间，插上梳齿，等20min凝固5.把制好的胶放进电泳槽，加好Running Buffer，检查密封性。如果要保存胶，可以用保鲜膜包裹，在4冰箱过夜6.拔出梳齿，取20-40L（80-120g）样品加入点样孔中，加好Marker，在80V恒压下电泳，当蛋白走出堆积胶后可加到100V半干法适合较小分子量的蛋白，湿法适合较大分子量。转膜（半干法） 20kD以下的蛋白应当用半干法1.取出完成电泳的PAGE胶，放在Transfer Buffer中，在左上角剪一个角作为标记; 取合适大小的PVDF膜，浸在甲醇中15s-5min，在左上角剪一个角作为标记。2.剪取略小于膜的滤纸2叠，每叠10张，把胶、膜、滤纸在Transfer Buffer中浸泡15分钟。3.按滤纸，PVDF，胶，滤纸的顺序铺在转膜仪上，注意上下层滤纸要比胶略小，不能越过胶直接接触在一起，以防短路4.用玻璃棒滚过滤纸，排除气泡5.100-150mA下按目标分子量大小,转膜1h-4h（电流按滤纸面积而定；时间依目标蛋白分子量而定，分子量越高，时间越长）6.（可选）把转完的胶放入考马斯亮蓝中染色观察，用洗脱液洗脱背景上的考马斯亮蓝转膜（湿法） 100kD以上的蛋白推荐用湿法转膜1.在实验前一天应当把冰盒放在-20度冰箱。在电泳时即应当准备好足够的冰。将转膜也预先稀释好，放在冰里预冷。2.剪好所需大小的PVDF膜，用甲醇浸泡15s-5min3.电泳完成后，把湿法转膜的塑料夹黑色一面朝下，在黑色塑料板上依次放上海绵、一层专用滤纸、凝胶、PVDF膜、专用滤纸、海绵4.合上塑料夹，把上方的夹子推到正中间。5.把塑料夹放进转膜槽里，把转膜槽放在电泳槽里，把电泳槽放在冰里6.把冰盒从-20度冰箱取出，放在电泳槽里。7.盖上盖子，接好电源，开始转膜。RASA1(120kD)使用300mA、2小时免疫标记 显影1.把转膜完成后的PVDF膜浸入Blocking Buffer中（TBST+5%牛奶），摇床上摇1h（或4过夜）2.倒去Blocking Buffer，将一抗按产品说明中的比例在TBST+1%牛奶中稀释（RASA1为1:100），与膜共孵1h（或4过夜）3.取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次10-30min4.按产品说明中的比例在TBST+1%牛奶中稀释二抗(1:2000)，与膜共孵1h5.取出PVDF膜，用TBST洗3次，每次10-30min6.将ECL底物以1：20稀释（900L水+两种20X底物各50L），在保鲜膜上与PVDF膜共孵1min7.用吸水纸吸干膜上残余底物，夹入暗盒中，注意蛋白面朝上。覆盖一张X光底片，0.5-30min后取出，在左上角剪一个角作为标记8.将底片在显影液中浸泡至有条带影像出现（10-20s），用水漂洗一下放进定影液中，洗去残余乳胶，待胶片变得透明，再用水冲洗干净，晾干。写上标记后扫描GAPDH 内参测定 (如果分子量相差不大就用同一块胶电泳，如果相差较大就做平行电泳或用大号电泳槽)9. 把转膜完成后的PVDF膜浸入Blocking Buffer中（TBST+5%牛奶），摇床上摇1h（或4过夜）10. 按产品说明中的比例在TBST+1%牛奶中稀释GAPDH抗体 (1:1000) ，与膜共孵1h11. 把PVDF膜用TBST洗3次，每次10-30min12. 将ECL底