左氧氟沙星中杂质的LC-MSMS定量分析方法及其市售制剂的质量评价研究.docx

ZHENG Ya-jie, ZHANG Rui-ping, GAO Yang, WANG Yu-cheng, WANG Ju-xian, HE Jiu-ming, ABLIZ Zeper. Impurity analysis and quality evaluation for commercial levofloxacin formulations using LC-MS/MS methodJ. Acta Pharm Sin, 2016, 51(3): 444-449.郑亚杰, 张瑞萍, 高杨, 王玉成, 王菊仙, 贺玖明, 再帕尔阿不力孜. 左氧氟沙星中杂质的LC-MS/MS定量分析方法及其市售制剂的质量评价研究J. 药学学报, 2016, 51(3): 444-449.左氧氟沙星中杂质的LC-MS/MS定量分析方法及其市售制剂的质量评价研究 郑亚杰1,2, 张瑞萍1, 高杨1, 王玉成3, 王菊仙3, 贺玖明1 , 再帕尔阿不力孜1 1. 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050;2. 湖南农业大学兽用中药资源与中兽药创制国家地方联合工程研究中心, 湖南长沙 410128;3. 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所, 北京 100050收稿日期: 2015-07-22; 修回日期: 2015-08-27.基金项目: 国家重大科学仪器设备开发专项资助项目(2012YQ14000805).* 通讯作者: Tel / Fax: 86-10-63165218, E-mail:摘要: 建立了左氧氟沙星制剂中微量杂质的LC-MS/MS定量及筛查方法,方法学考察表明该方法快速、灵敏度高和专属性强。利用该方法对19个厂家市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行检测和质量评价。上述样品中超过杂质限度的杂质共检出5种,且不同厂家制剂中的杂质含量差异较大,仅3个厂家制剂中杂质的含量均低于0.01%。左氧氟沙星的N4-甲基季铵类杂质在左氧氟沙星制剂中首次检出。结合杂质来源,认为左氧氟沙星药物制剂中杂质水平的差异与原料药、制剂工艺参数的控制及运输储藏的环境有着密切关系。该方法能专属、灵敏和全面地检测药物制剂中的杂质,为客观评价制剂质量及质量控制提供了高效的分析手段,所检出杂质种类及含量水平能客观地反映左氧氟沙星制剂的质量。 关键词: 左氧氟沙星 杂质 液质联用 制剂 质量评价 Impurity analysis and quality evaluation for commercial levofloxacin formulations using LC-MS/MS method ZHENG Ya-jie1,2, ZHANG Rui-ping1, GAO Yang1, WANG Yu-cheng3, WANG Ju-xian3, HE Jiu-ming1 , ABLIZ Zeper1 1. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China;2. Veterinary Herb Resources and Drug Development National-local Joint Engineering Research Center, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;3. Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, ChinaAbstract: The study aims to develop a rapid, specific and sensitive method for quantitative analysis of trace impurities in levofloxacin formulation using LC-MS/MS. The quality of the different formulations from 19 plants was evaluated in the contents of the impurities. The results indicated that there were 5 impurities in the samples, and the content was different in the products with same formulation by different plants. The products of 3 plants were in good quality with impurities level under 0.01%. Levofloxacin N4-methyl quaternary impurity was first reported as the formulation impurity. The impurities were tightly correlated to the reservation of drug, process control of formulation and storage during transportation. The results suggest that our method is sensitive and specific to detect the trace impurities in formulation, and can be used to monitor the quality of commercial drug product. Key words: levofloxacin impurity LC-MS/MS formulation quality evaluation 左氧氟沙星是以4-喹诺酮为母核的人工合成抗菌素,因其具有抗菌谱广、抗菌效率高和体内生物利用度好等特点,已成为临床上广泛使用的抗菌类药物之一1,2。据20112013年国家药品不良反应监测年度报告,喹诺酮类药物的严重不良反应报告数量居抗感染药物不良反应/事件的前三位,左氧氟沙星药物的不良反应报道居该类药物的首位。药物不良反应除药物自身理化性质外,与药物中的杂质也有密切关系1,3。根据ICH指导原则,对于原料药和制剂中存在的工艺相关杂质 (impurity,IMP) 和降解产物 (degradation product,DP),尤其是超过鉴定阈值或随着时间呈增加趋势的杂质必须进行杂质结构研究,并建立杂质的定量分析方法,为杂质的限度控制和药物的质量控制提供必要的数据支持4。 基于LC-MS/MS技术的多反应离子监测 (multiple reaction monitoring,MRM) 方法具有灵敏、准确和选择性强等特点,能够有效地排除干扰离子,因此被广泛用于复杂样品体系中微量成分的定量分析5, 6, 7, 8。本课题组前期开展了基于LC-MS/MS技术的左氧氟沙星原料药中微量杂质的定性分析方法研究,利用该方法结合强制破坏实验对药物原料药中可能产生的杂质结构及其来源进行了阐明,鉴定出20个左氧氟沙星相关的杂质9。由于实验室的强制破坏条件并不完全代表原料药和制剂生产、存储和流通等环节中实际的化学或环境影响因素,因此有必要对市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行分析检测,了解杂质在制剂中的实际存在状况。 本研究开展了基于LC-MS/MS技术的药物制剂中杂质的定量分析与筛查方法研究,针对市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行全面、准确、快速地检测,完成不同厂家的市售药物制剂中杂质的筛查检测,并对其质量进行初步评价,为左氧氟沙星药物制剂的质量控制及安全性评价提供参考。 材料与方法仪器与试药 Agilent 1200 Series快速高效液相色谱仪 (安捷伦公司,美国); QTRAPTM四极杆-线性离子阱串联质谱仪 (QTRAP 5500,美国AB Sciex公司),配备Turbo Ion spray (ESI) 离子源以及Analyst 1.5.1数据采集和处理系统; 分析天平 (METTLER TOLEDO AG135型,梅特勒-托利多仪器有限公司); Eppendorf微量移液器和移液管。左氧氟沙星对照品 及氧氟沙星杂质A对照品均购自中国食品药品检定研究院; descarboxyl levofloxacin,desmethyl levofloxacin hydrochloride和N,N-desethylene levofloxacin hydrochloride,购自加拿大TRC (Toronto Research Chemicals Inc.) 公司。左氧氟沙星季铵盐由中国医学科学院医药生物技术研究所王玉成研究员课题组提供。左氧氟沙星片剂、胶囊和滴眼液等均为市售药品; 甲醇和甲酸 (色谱纯) 购自Merck公司; 实验用水为娃哈哈纯净水。 对照品溶液的配制分别精密称取上述各对照品适量,加甲醇超声溶解并定容,得到质量浓度约为0.5 mgL-1的溶液,作为储备液。吸取上述储备液各适量体积,混匀配制成所需浓度的混合标准品溶液。 样品预处理取片剂样品各10片,分别研细,备用; 取胶囊样品各10粒,取内容物,分别混匀,备用; 液体制剂样品直接取样不需经预处理。 供试品溶液的配制取上述预处理后的市售 制剂样品各适量,分别加入一定体积的甲醇,固体制剂样品分别超声提取1 h,放至室温后补足失重,离心取上清液各适量,加甲醇稀释至含左氧氟沙星约 2 gmL-1,备用。液体制剂样品直接用甲醇稀释至 相应浓度,备用。样品制备过程中随行空白溶剂,得到空白样品溶液。 色谱条件采用Agilent Zorbax SB-C18 (150 mm 4.6 mm,5 m) 色谱柱 (含在线过滤器); 流动相为甲醇 (A)-0.3%甲酸水 (B),采用梯度洗脱,进样前用起始流动相预平衡色谱柱5 min,梯度洗脱条件为 t (min)/A%: 0/58/2218/2230/6035/6036/5; 柱温为30 ; 流速为1.0 mLmin-1,柱后分流约30%注入质谱仪; 进样体积为5 L。 质谱条件 在ESI正离子模式下检测,离子源温度为450 ,喷雾电压 (IS) 为5.5 kV,雾化气 (GS1) 压力为60 psi (1 psi 6.9 kPa),辅助气 (GS2) 压力为40 psi,入口电压 (EP) 为10 V; 采用MRM扫描方式测定,Q1和Q3的分辨率均设为Unit; 被列入MRM方法中的每个杂质选取 M+H+ 分子离子与两个相对丰度最高或特异的子离子组成离子对 (transition),对其解簇电压 (decluster potential,DP) 和碰撞能量 (collision energy ,CE) 进行了优化,优化后参数如表 1所示。 表1(Table 1)Table 1 The parameters for LC-MS/MS analysis of impurities and drug. DP-1 DP-17 are the degradation products (DPs). IMP-1 IMP-3 are the process impurities (IMPs). All of the above DPs and IMPs are listed in the table according to their retention time, which were identified by LC-MS/MS9. DP-8, DP-12, DP-14, DP-15, IMP-1 and IMP-3 are respectively descarboxyl levofloxacin, N, N - desethylene levofloxacin, desmethyl levofloxacin, levofloxacin N-oxide, levofloxacin quaternary ammonium salt and ofloxacin acid. The quantitative transitions list in left column while the qualitative transitions in right column NameTransitionDwell time/msDecluster potential/VCollision energy/eVDP-1394.1305.1394.1287.110015030DP-2394.1294.1394.1250.110015030DP-3330.1286.1330.1271.110015030DP-4332.1261.1332.172.010015030DP-5346.1302.1346.1260.010015030DP-6334.1314.1334.1277.010015030DP-7292.1272.1292.1235.110015030DP-8318.1261.1318.1270.110017037DP-9364.1346.1364.1289.110015030DP-10,11394.1360.1394.1316.110015030IMP-1376.1332.1376.172.010015032IMP-2390.1346.1390.1318.110015030Levofloxacin362.1318.1362.1261.15014028DP-12336.1298.1336.1318.110013034DP-13322.1304.1322.1284.110015030DP-14348.1304.1348.1261.110014028DP-15378.1317.1378.1361.110014032DP-16279.1261.0309.1219.010015030DP-17309.1219.0309.1245.010015030IMP-3282.0264.0282.0224.01009030Table 1 The parameters for LC-MS/MS analysis of impurities and drug. DP-1 DP-17 are the degradation products (DPs). IMP-1 IMP-3 are the process impurities (IMPs). All of the above DPs and IMPs are listed in the table according to their retention time, which were identified by LC-MS/MS9. DP-8, DP-12, DP-14, DP-15, IMP-1 and IMP-3 are respectively descarboxyl levofloxacin, N, N - desethylene levofloxacin, desmethyl levofloxacin, levofloxacin N-oxide, levofloxacin quaternary ammonium salt and ofloxacin acid. The quantitative transitions list in left column while the qualitative transitions in right column 方法学考察 吸取各对照品储备液适量,配制系列浓度的混合对照品溶液; 选取其中一个浓度的对照品溶液和空白样品溶液,按上述LC-MS/MS方法进行分析,考察方法的专属性。 配制系列浓度的对照品溶液,按上述色谱和质谱条件进行LC-MS/MS谱分析,以提取离子色谱峰峰面积值对浓度进行线性回归并计算相关系数。 取混合对照品溶液逐步稀释进样,考察该方法下各目标化合物的检测限及定量限; 取同一浓度的混合对照品溶液在上述实验条件下连续进样6次,进行仪器的精密度考察; 取相同厂家同一批号样品,按“供试品溶液的配制”项下方法制备供试品溶液6份 (含左氧氟沙星约20 ngmL-1),在上述实验条件下进样,进行重复性实验。 取相同厂家同一批号样品9份,加入3个浓度的药物和杂质对照品,每个浓度平行3份,按“供试品溶液的配制”项下方法进行样品溶液的制备,进行LC-MS/MS分析,将目标待测物的提取离子色谱峰峰面积代入线性回归方程计算目标待测物的浓度、测定值与理论值的差值,考察方法的准确性。 取同一浓度的混合标准品溶液,在LC-MS/MS分析条件下,对流速、柱温和流动相酸水浓度等进行考察,计算目标化合物的提取离子色谱峰峰面积的RSD值,对方法的耐用性进行考察。 结 果 1 LC-MS/MS 分析方法建立和验证1.1 专属性取2 ngL-1的混合对照品溶液和空白样品溶液进行LC-MS/MS分析,在与杂质对照品相同保留时间的出峰位置,空白样品无干扰,左氧氟沙星对照品和杂质对照品的保留时间见表 2。 表2(Table 2)Table 2 The linear equations of levofloxacin and impurity standards CompoundtR/minLinearityCorrelation coefficientRange/ngmL1DP-89.71y = 3.14e4 x + 3.42e40.998 22200IMP-113.27y = 1.12e5 x 1.44e50.990 51.260Levofloxacin16.85y = 1.12e5 x + 9.51e30.998 62100DP-1217.60y =6.71e3 x 7.19e30.990 6101 000DP-1418.29y = 2.45e5 x + 1.64e40.999 10.660DP-1524.37y = 5.83e4 x + 3.38e30.999 90.6120IMP-333.08y = 3.11e4 x + 2.49e40.999 41100Table 2 The linear equations of levofloxacin and impurity standards 1.2 精密度、检出限和定量限按上述LC-MS/MS方法对精密度、检出限和定量限进行考察,药物及杂质的日内精密度RSD在0.83%4.09%,日间精密度RSD在2.41%12.84%,方法对各杂质的检出限在0.1611.77 ngmL-1,定量限在0.5039.24 ngmL-1。 1.3 线性关系通过对系列混合对照品溶液进行LC- MS/MS分析,由Analyst 1.5.1的数据处理软件给出各目标化合物的线性回归曲线和相关系数 (表 2)。 1.4 重复性选取厂家4 (批号: 113005) 为代表样品,平行制备6份供试品溶液,进行LC-MS/MS分析。因杂质离子的提取离子峰面积值偏小,不在线性范围内,因此仅计算了左氧氟沙星药物本身的相关数据,其RSD为0.11%。 1.5 加样回收率左氧氟沙星对照品按50%、100%和150% 三个水平在已知含量的样品粉末中添加,杂质对照品的添加量为0.05、0.1和0.2 mg,按供试品溶液的配制方法制得样品溶液,进行LC-MS/MS分析。除化合物 (离子对: 282.1264.1) 的回收率为63.21%,其余目标化合物的回收率在80%105%。 1.6 耐用性取同一浓度的混合对照品溶液,对可能影响分析条件的流速 (0.8、1.0和1.2 mLmin-1)、柱温 (25、30和35 ) 和流动相酸水浓度 (0.2%、0.3% 和0.4%) 进行考察,除上述条件外按设定的LC-MS/MS分析条件进样分析,计算各目标分析物浓度的RSD为2.52%3.93%,表明该分析方法耐用性良好,不易受分析条件的微小波动影响。 2 市售左氧氟沙星中杂质的LC-MS/MS筛查 按照“供试品溶液的配制”项下方法制备供试品溶液,在上述实验条件下进行测定,结果见图 1和表 3。从19个不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂样品 (S1S19) 中仅检出了表 1所列的5种杂质,包括1种工艺相关杂质 (IMP-1) 和4种降解产物 (DP-8、DP-12、DP-14和DP-15),这些降解产物分 别在酸性 (DP-8)、光照 (DP-12和DP-14) 和氧化 (DP-15) 条件下由药物降解生成9。不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中杂质的含量存在较大差异,S14S16三个厂家的样品中杂质含量远低于其他厂家。DP-14在所有样品中均被检出且含量较其他杂质相对偏高,其次为DP-12和DP-15。 Figure 1Figure 1Figure 1 The contents of impurities in the levofloxacin formulation samples (S1S19) from different pharmaceutical plants表3(Table 3)Table 3 The results of impurities in the levofloxacin formulation samples (S1S19) from different pharmaceutical plants. ND: No detection SampleFormulationPlant (Batch Number)Content/%DP-8IMP-1DP-12DP-14DP-15S1TabletsPlant 1 (B1200031)0.0010.005ND0.1330.043S2TabletsPlant 2 (120901)ND0.004ND0.0800.002S3TabletsPlant 3 (121004)0.0020.0070.0330.1600.036S4TabletsPlant 4 (1130005)0.0010.0040.0380.0950.004S5TabletsPlant 5 (6130310113)0.0020.0050.0600.1100.010S6CapsulesPlant 6 (30303104)0.0020.0070.0400.1370.016S7CapsulesPlant 7 (121201)0.0020.0060.0460.1840.017S8CapsulesPlant 8 (1301013)ND0.0020.0400.1130.006S9CapsulesPlant 9 (120171021)ND0.0110.0470.1110.016S10CapsulesPlant 10 (130302)ND0.0090.0330.1660.012S11CapsulesPlant 11 (130301)ND0.0030.0400.1060.007S12InjectionPlant 12 (1209053)0.0300.0650.2670.2690.110S13InjectionPlant 12 (12082431)0.0310.0300.1400.1170.043S14InjectionPlant 12 (13031431)0.0020.0020.0100.0080.003S15InjectionPlant 13 (1303086221)0.0020.0020.0040.0110.003S16InjectionPlant 14 (1301405)0.0020.0020.0090.0100.002S17Sodium chloride injectionPlant 15 (121030169)0.0510.0540.1100.2850.087S18Eye dropsPlant 16 (13031801)0.0260.0380.0530.2210.036S19Eye dropsPlant 17 (30106208)0.0230.0310.0600.2770.034Table 3 The results of impurities in the levofloxacin formulation samples (S1S19) from different pharmaceutical plants. ND: No detection 讨 论由于杂质对照品的获取成本高,因而针对所有可能杂质建立定量分析方法具有很大难度。本研究利用LC-MS/MS分析的高灵敏和高特异性,建立了一种同时检测左氧氟沙星药物制剂中20种杂质的筛查方法。对于不能够获取对照品的15种杂质,利用不加校正因子的主成分自身对照法对市售左氧氟沙星制剂中的这些杂质进行定量筛查,能够更加全面地获得药物中杂质的存在情况和含量水平。 本研究建立的LC-MS/MS定量分析方法专属性强、灵敏度高,可定量检出制剂中相对于药物含量高于0.1% 的杂质,能够满足ICH相关指导原则分析方法的要求。利用该方法对不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中的杂质进行了筛查,从所有样品中仅检测出5种杂质,分别为IMP-1、DP-8、DP-12、DP-14和DP-15。除IMP-1为原料药中带入的工艺杂质,DP-8等杂质均为左氧氟沙星在酸性、光照和氧化条件下降解产生的主要杂质9。在实验室强制破坏实验条件下产生的降解产物大多数未被检出,分析认为与强制破坏条件相比,实际制剂样品在生产、运输或储存过程中的条件均相对温和,因此大多数杂质不会产生或者含量不一定会增加。但如果保存条件不 当或工艺条件未能得到很好控制,上述杂质就会产生或含量增加而被检出。此方法获得的检测结果能 够反映最终药品制剂的质量情况。另外,通过与文献9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16进行比较,工艺杂质IMP-1是左氧氟沙星的N4 -甲基季铵类化合物,在左氧氟沙星制剂中的检出报道尚属首次。 研究结果表明,不同厂家的药品杂质控制水平存在一定的差异,其中S14S16三个不同厂家药 物制剂中所检出杂质的含量均低于0.01%,而另外16个市售制剂中杂质的含量相对较高,尤其是S12和S17S19四个不同厂家的市售左氧氟沙星药物制剂中杂质含量明显偏高。结合本课题组前期研究结果,作者认为本研究中不同厂家制剂样品的检测结果产生的明显差异可能与制剂生产工艺或工艺参数控制的不同有关。 本研究建立的LC-MS/MS分析方法较LC-UV10, 17方法具有更好的专属性和灵敏度; 在不需要全部对照品的情况下,可针对更广泛的杂质种类和市售制剂品种开展定量分析和质量评价工作,为客观评价左氧氟沙星药物质量及质控水平提供了有效手段。 参考文献 1Domagala JM. Structure-activity and structure-side-effect relationships for the quinolone antibacterialsJ. J Antimicrob Chemother, 1994, 33:685-706. 2Kresse H, Belsey MJ, Rovini H. The antibacterial drugs marketJ. Nat Rev Drug Discov, 2007, 6:19-20. 3Mandell L, Tillotson G. Safety of fluoroquinolones:an updateJ. Can J Infect Dis, 2002, 13:54-61. 4ICH Guidelines Q3A(R1). Impurities in New Drug SubstancesM. Geneva:IFPMA, 2002. 5Yu X, Warme C, Lee D, et al. Characterization of a low-level unknown isomeric degradation product using an integrated online-offline top-down tandem mass spectrometry platformJ. Anal Chem, 2013, 85:8964-8967. 6Wu CS, Wang CH, Zhang JL, et al. Separation, determination of six impurities in methotrexate drug substance using ultraperformance liquid chromatographyJ. Chin Chem Lett, 2014, 25:447-450. 7Wang MJ, Hu CQ. Impurity profiling of macrolide antibiotics by liquid chromatograpy-mass spectrometryJ. Acta Pharm Sin (药学学报), 2013, 48:642-647. 8Li J, Huang HW, Zhang H, et al. The impurity profiling of simvastatin and its tabletsby UPLC-MS/MSJ. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49:672-678. 9Zheng YJ, He JM, Zhang RP, et al. An integrated approach for detection and characterization of the trace impurities in levofloxacin using liquid chromatography-tandem