蛋白质羰基含量检测.doc

苏州大学实验报告姓名 孙海洪 学号 20094221059 专业 生物化学与分子生物学实验名称 蛋白质羰基含量检测 实验日期 2009.12.2一、实验目的通过实验掌握蛋白羰基含量测定的原理和操作方法以及掌握蛋白羰基含量检测试剂盒的使用方法。2、 实验原理蛋白质是生命活动的物质基础,约占人体固体成分的45%，在维持细胞、组织的生长、更新、修补，以及催化、运输、代谢调节等生命活动中起重要作用。蛋白质以很高的浓度存在于细胞、组织当中,就使它成为自由基攻击的一个主要目标。几乎组成蛋白质的所有氨基酸对OH 及O-2 攻击都很敏感。蛋白质侧链氨基酸被氧化修饰后羰基的含量大大增加并成为蛋白质丧失正常功能甚至被降解的重要原因。1987年Oliver等人经研究提出可以用蛋白质羰基含量作为判定蛋白质氧化损伤的一项指标。蛋白质羰基化是指氨基酸残基侧链中的氨基或亚氨基受到氧自由基攻击最后转变成醛基,并释放NH3+的过程。其在体内的形成主要是通过金属离子催化氧化系统完成。在这个过程中，二价铁离子与蛋白质上的氨基酸残基形成铁()一蛋白质配位复合物。H202作用于此配位复合物的铁()上，产生OH、OH- 和铁()一蛋白质配位复合物。OH从侧链氨基酸上提出一个氢原子，使侧链氨基酸上的碳上有一个不配对电子。在此不配对电子作用下，铁()一蛋白质配位复合物又重新变回铁()一蛋白质配位复合物，随后配位键断开，二价铁离子和NH3+与复合物分离，由此在蛋白质侧链形成羰基或羰基衍生物。蛋白质中的赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸残基都有可能参与羰基化。蛋白羰基含量检测试剂盒是一种现代条件下检测蛋白羰基含量的快捷手段。可简便灵敏的检测各种器官、血清、培养细胞和细胞器等蛋白质羰基含量。其使用不需要昂贵的设备，样品处理简单，可广泛应用于各种疾病如衰老、动脉硬化症、糖尿病和帕金森综合症、风湿性关节炎等疾病的早期诊疗，抗氧化保健食品、抗氧化药物和化妆品的评价，还可以用于评价由于一些环境有害因子如辐射、化学毒物等对机体造成的氧化损伤。本实验涉及的蛋白质羰基含量测定数学公式，如下：样本蛋白含量的测定：蛋白质分子具有NH3+ 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准样液或样品中时，考马斯亮兰上的阴离子与蛋白上的NH3+结合，使溶液变为蓝色，通过测定吸光度可计算蛋白含量：实验器材1. 实验对象： 8周龄小鼠2. 实验仪器：紫外分光光度计、离心机、微量移液器、电子天平、研钵、烧杯、0.5cm光径石英比色皿、滤纸等3. 实验试剂：a. 试剂盒组成和配置：试剂一：匀浆介质，无色透明液体，100ml1瓶；4保存；试剂二：浅砖红色液体，5ml1瓶；4避光保存；试剂三：黄色液体，20ml1瓶；4避光保存；试剂四：无色液体，20ml1瓶；4保存；试剂五：无色液体，60ml1瓶；4保存；试剂六：无色液体，70ml1瓶；4保存；b. 自备试剂：无水乙醇 (分析纯)乙酸乙酯 (分析纯)c. 无水乙醇乙酸乙酯混合应用液的配置：将无水乙醇和乙酸乙酯按体积比 1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。考马斯亮兰贮备液 蛋白标准液：0.563g/L4、 实验步骤1. 组织获取： 8周龄小鼠个处死一只，分别取待测组织肝脏。至于0.9%生理盐水中，备用。2. 组织匀浆的制备：取组织块0.1克，在冰冷的生理盐水中漂洗干净，滤纸拭干，按照重量体积比1：9的比例加入试剂一（0.1克的组织中加入0.9ml的试剂一），在冰浴条件下机械匀浆，将匀浆液用离心机3000r/min离心10min，取上清即10%匀浆进行测定；3. 取10%匀浆450l，加入50l试剂二，室温放置10min后，11000r/min离心10min，取上清进行蛋白质羰基的测定，同时取部分上清用于考马斯亮蓝试剂盒测定匀浆的蛋白含量；4. 以下操作如表一所示：表一 上清液的试剂盒操作加入试剂（ml）测定管对照管上清液0.10.1试剂三0.4试剂四0.4漩涡混匀1min，37准确避光反应30min试剂五1.01.0漩涡混匀1min，在4下，以12000r/m离心10min，弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀1min，在4下，以12000r/m离心10min，弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀1min，在4下，以12000r/m离心10min，弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀1min，在4下，以12000r/m离心10min，弃上清液，留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合液1.01.0漩涡混匀1min，在4下，以12000r/m离心10min，弃上清液，留沉淀试剂六1.01.0混匀后，37准确水浴15min漩涡混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处（紫外），0.5cm光径石英比色皿，试剂六调零，测定OD。蛋白含量的测定：空白管标准管测定管蒸馏水0.50.563g/L标准液0.5样品ml0.05考马斯亮兰ml3.03.03.05、 实验数据及数据处理1. 根据公式：空白管OD值=0 标准管OD值=0.16 测定管OD值=0.365 稀释了5倍 则：蛋白含量为6.422g/L 测定管OD=0.035 对照管OD=0.017 比色光径=0.5cm 蛋白浓度=6.422g/L则： 蛋白质羰基含量为3.185 n mol/mg prot六、 讨论蛋白质对自由基的敏感性取决于氨基酸的组成，以及这些氨基酸在维持该蛋白质结构和功能方面的地位。此外，蛋白质在组织、细胞内的位置及自由基的种类和性质也影响蛋白质损伤的程度。羟自由基可直接作用于肽键，使肽键断裂，并在断裂处产生羰基。蛋白质侧链氨基酸受到自由基攻击被氧化修饰后将使羰基的含量大大增加。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，也是自由基对蛋白质攻击的标志。由于蛋白质羰基含量可直接