产酸克氏杆菌1,３丙二醇发酵液中2,３丁二醇的定性和定量分析.doc

产酸克氏杆菌1,丙二醇发酵液中2,丁二醇的定性和定量分析【摘要】产酸克氏杆菌（Klebsiella oxytoca）在厌氧和微好氧条件下均可以发酵甘油产生1,丙二醇。相对于厌氧发酵液，在微好氧发酵液的高效液相色谱图中出现两个未知物峰。对微好氧发酵液进行离心，脱盐和蒸馏处理，以两未知物质为主要成分的馏分通过气相色谱质谱联机分析显示两种未知物质均为2,丁二醇，通过气相色谱和高效液相色谱分析确定两未知物质分别为meso2,丁二醇和(+),丁二醇。建立了用HPLC法对meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇进行外标定量的测定方法，在标准品浓度1001200 mg/L范围内，meso2,丁二醇线性方程为y=706x，r=0.999；(+)2,丁二醇线性方程为y=706x，r=09998。在发酵液样品中meso2,丁二醇的回收率为9967；相对标准偏差RSD为0.35，(+)2,丁二醇的回收率为9989；相对标准偏差RSD为0.09。 【关键词】 2,丁二醇，定性分析，定量分析，高效液相色谱，产酸克氏杆菌1 引言1,丙二醇和2,丁二醇均为重要的化工原料，具有很好的应用前景。1,丙二醇可用作生产聚酯和聚氨酯的单体，近年来随着对新型聚酯对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的应用开发，1,丙二醇的需求量不断增大13。目前，1,丙二醇工业化生产均采用化学合成法。但由于可以利用成本较低的可再生资源且不会带来严重的环境污染，用微生物发酵法生产1,丙二醇近年来成为研究热点1, 2。2,丁二醇广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等各个领域4，。由于结构特殊，化学法合成2,丁二醇成本很高，目前生产2,丁二醇均采用发酵法。克雷伯氏菌是用于2,丁二醇生产的重要菌种，可以发酵葡萄糖产生meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇的混合物，7。在厌氧条件下，产酸克氏杆菌可以发酵甘油产生1,丙二醇，同时产生丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇等副产物。底物甘油和这些产物均可用高效液相色谱进行分析。但用高效液相色谱分析微好氧条件下的发酵液时，除上述物质峰外还出现了两个未知物。本实验采用气质联机、气相色谱和高效液相色谱分析确定两个未知物分别为meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇，并建立了用高效液相色谱定量分析两种2,丁二醇的方法。2 实验部分2.1 仪器和试剂高效液相色谱仪包括510系统和2414示差折光检测器（美国ater公司）;色谱柱为BioRad 公司Aminex HPX87H 强酸阳离子交换树脂柱，柱温65，检测器温度45；流动相为0.005 mol/L H2SO4，流速为0.8 mL/min。分析软件：北京创新通恒科技有限公司CXTH3000色谱工作站。VECTOR33型傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司); TURBOMASSAUTOSYSTEM XL型气质联用仪(美国PerkinElmer公司)，DBWAX的30 m×0.32 mm石英毛细管柱；初始温度为100(2 min)10/min200(2 min)，载气为高纯氦气，流速0.8 mL/min，进样口温度200；传输管温度220；EI电子源，电子能量70 eV；溶剂延迟3 min，进样量0.2 μL。检索谱库为：NIST和WILEY数据库的质谱计算机数据系统。7890F型气相色谱仪(上海天美公司)，毛细管柱(16 m×0.25 mm, 0.33 μm), 柱温150；进样口温度180，FID检测器温度为180, 灵敏度为9，衰减为0，载气为高纯氮气，流速为1.0 mL/min，进样器分流比为551，进样量0.5 μL。分析软件：浙江大学智能分析研究所N2000数据工作站。1,丙二醇、(+)2,丁二醇和meso2,丁二醇(Aldrich公司,色谱纯）；其它试剂为分析纯。2.2 样品处理方法发酵液脱盐：D001×7阳离子交换树脂填充柱，用1 mol/L HCl转换成H型；D201×7阴离子交换树脂填充柱，用1 mol/L的NaOH转换成OH型。离心后的发酵液先流过阳离子交换树脂填充柱，再流过阴离子交换树脂填充柱。发酵液在流经柱前后通过高效液相色谱分析检查其中各组分浓度变化。脱盐后发酵液在常压下置于圆底烧瓶中加热至沸腾，温度升到110停止，HPLC法分析组分变化。浓缩发酵液置于连有抽真空装置的简单蒸瓶中加热，分段收集馏分并用HPLC法分析馏分组成。标准品溶液制备：分别称取(+)2,丁二醇0.1144 g和meso2,丁二醇0.1115 g，用超纯水溶解并定容至100 mL，再用超纯水稀释成所需浓度的标准溶液。3 结果和讨论3.1 厌氧发酵液和微好氧发酵液高效液相色谱分析比较将发酵液稀释100倍，12000 r/min离心10 min，上清液用于高效液相色谱分析（如图1）.发现微好氧发酵液中除底物甘油（10.188 min）、丁二酸（8.718 min）、乳酸（9.690 min）、乙酸（11.222 min）、1,丙二醇（13.201 min）、乙醇（16.270 min）外，还有另外两种未知物质，保留时间分别为13.788 min（峰1）和14.545 min（峰2）。图1 厌氧发酵液（a）和微好氧发酵液(b)高效液相色谱图（略）Fig1 Chromatograms of fermentation broth under anaerobic (a) and microaerobic (b) conditions3.2 厌氧发酵液和微好氧发酵液红外光谱分析比较分别取离心过的厌氧发酵液和微好氧发酵液20 μL，滴至硒化锌载片上，风干，置傅立叶变换红外光谱仪中扫描.波数范围4004000 cm-1，扫描条件为每2 cm-1波数取值一次，每个样品扫描64次，取其平均值绘制出红外光谱图（如图2），并进行谱图比较分析。经分析微好氧发酵液中的两未知物质并没有出现羧基和羟基以外的其它特殊官能团，故推断两未知物质为有机酸或醇类物质。3.3 发酵液脱盐微氧发酵液通过阳离子交换柱和阴离子交换柱后，琥珀酸、乳酸和乙酸的相对含量有明显的降低，液相色谱谱图中已看不到明显的峰，而甘油、1,丙二醇、乙醇和两个未知峰的峰值无明显变化。由此可知未知物质不是有机酸。将脱盐后的发酵液加热浓缩，取少量浓缩液稀释至初始浓度后用高效液相色谱分析,发现两未知物质的含量没有明显变化，由此可知二者沸点较高。图2 厌氧发酵液（a）和微氧发酵液(b)红外光谱图（略）Fig.2 Infrared spectra of fermentation broth under anaerobic (a) and microaerobic conditions (b)3.4 浓缩后发酵液蒸馏发酵液浓缩后,在真空下蒸馏，分段收集初始、中间和后期的馏分。经高效液相色谱分析，初始阶段的馏分主要含两个未知物和少量1,丙二醇；中间阶段的馏分主要含1,丙二醇，两个未知物也各有少量；后期馏分主要含甘油和少量1,丙二醇。由此可知两未知物沸点均低于甘油和1,丙二醇。3. 馏分气质联机分析将初始阶段馏分通过气质联机进行分子结构分析，两未知物和1,丙二醇在总离子流图（图 3）中能够很好的分开。质谱谱图（图 4、图 5和图 6）经过NIST和WILEY数据库的质谱计算机数据系统检索及分析，总离子流图中5.44 min和5.82 min的峰均为2,丁二醇(WILEY 3200)，7.93 min的峰为1,丙二醇(NIST 122)。由于2,丁二醇具有手性碳原子，所以两未知物应该是2,丁二醇的两种光学异构体。 图3 馏分气质联机总离子流图（略）Fig3 TIC of distillate by GC/MS 图4 峰(5.44)的质谱图（略）Fig4 ass spectra of peak (5.44)图5 峰(5.82)的质谱图（略）Fig5 ass spectra of peak(5.82) 图6 峰(7.93)的质谱图（略）Fig6 ass spectra of peak(7.93)3. 馏分和标准品气相色谱分析2,丁二醇有种光学异构体，克雷伯氏菌可以发酵葡萄糖产生大量meso2,丁二醇和少量(+)2,丁二醇的混合物，故推断两未知物分别为meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇。用气相色谱对馏分和meso2,丁二醇及(+)2,丁二醇标准品进行分析以确定两未知物构型。馏分经气相色谱分析有个峰，两未知物保留时间分别为3.623 min和3.823 min，1,丙二醇保留时间为5107 min。对meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇标准品进行气相色谱分析，并与馏分气相色谱图对照得知保留时间为3.623 min的为(+)2,丁二醇，保留时间为3.823 min的为meso2,丁二醇。3. 标准品高效液相色谱分析对meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇标准品进行高效液相色谱分析。meso2,丁二醇保留时间为13. 784 min，(+)2,丁二醇保留时间为14.547 min。由此可知，对应于高效液相色谱谱图中峰1的物质为meso2,丁二醇；对应于峰2的物质为(+)2,丁二醇。通过定量环定量进样20 μL，每个浓度重复测定3次，取峰面积平均值和浓度作图，绘制标准曲线。在标准品浓度1001200 r/min范围内， meso2,丁二醇线性方程为y=7×06x(y为样品浓度，x为峰面积)，r=0.9991；(+)2,丁二醇线性方程为y=7×06x，r=0.9998。3. 添加回收实验某次发酵液中meso2,丁二醇浓度为24.11 g/L，(+)2,丁二醇浓度为17.86 g/L，往其中分别添加22.24 g/L的meso2,丁二醇标准溶液和14.93 g/L的(+)2,丁二醇标准溶液，用高效液相色谱测定6次，取平均值并计算回收率和相对标准偏差(表1)。meso2,丁二醇的回收率为9967，RSD0.35； (+)2,丁二醇的回收率为9989，RSD0.09。表1 液相色谱测定meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇的回收率和相对标准偏差（略）Table 1 Recovery and RSD of meso2,butanediol (BD) and (+)2,BD by HPLC结果表明，产酸克氏杆菌在微好氧条件下发酵甘油，在1,丙二醇的发酵液中产生了meso2,丁二醇和(+)2,丁二醇。建立了用法测定(+)2,丁二醇和meso2,丁二醇方法。【参考文献】 Biebl, enzelK, Zeng A P, Deckwer W D. Appl Microbiol Biotechnol， 1999, 52(3): 289297Zeng A P， Biebl H. Adv Biochem Eng Biotechnol， 2002, 74: 239259Xiu Zhilong (修志龙). Modern hemical Industry(现代化工), 1999, 19(3): 3335Syu M J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001, 55: 1018Ma Chengwei (马成伟)， Du ong (杜彤)， Sun Yaqin (孙亚琴)， Xiu Zhilong (修志龙). Fine and Specialty