产糖化酶菌株的诱变.doc

产糖化酶菌株的诱变一、实验目的1）学习了解工业微生物育种的基本原理。2）学习利用物理因素（紫外光）诱变育种的方法。3）对有一定能力产糖化酶的菌种进行紫外线诱变，并获得产酶能力更强的突变菌株。二、实验原理利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞的遗传物质的分子结构发生改变，从而引起菌体发生遗传性的变异，再用合理的筛选方法从群体中筛选出少数具有优良性状的菌株，这种育种方法称为诱变育种。诱变育种是提高菌种产量，获得新型变异菌株的主要手段。紫外线（UV）是一种最常用有效的物理诱变因素。其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变（链或氢键的断裂，胞嘧啶的水合作用、胸腺嘧啶二聚体的形成）而造成的。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线杀菌灯，照射距离为20cm30cm，照射时间为13min，死亡率控制在50%80%为宜，被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞菌悬液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯菌的出现。三、实验材料1、微生物菌种 产糖化酶的霉菌2、培养基与试剂1） 增值培养基：硝酸钠 ：2g磷酸氢二钾 ：1g硫酸镁 :0.5g氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g蔗糖 :30g琼脂:15g筛选培养基：可溶性淀粉 1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO47H2O0.05%,FeSO7HO0.001%、琼脂粉1.8%加热溶解，分装后121灭菌20min、自然pH。诱导产生孢子：在37和5的条件下交替进行培养。3、玻璃器皿：培养皿30套、150mL三角瓶、试管数支、量筒、接种环等4、仪器：恒温摇床培养箱、紫外灯（30W）、电子天平、超净工作台、冷藏箱、高压蒸汽灭菌锅。四、实验方法和步骤（一）培养基的制备增值培养基：硝酸钠 ：2g磷酸氢二钾 ：1g硫酸镁 :0.5g氯化钾 0.5g硫酸亚铁 0.01g蔗糖 :30g琼脂:15g筛选培养基：可溶性淀粉 1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO47H2O0.05%,FeSO7HO0.001%、琼脂粉1.8%加热溶解，分装后121灭菌20min、自然pH。（二）灭菌与平板斜面制备将装有培养基的三角瓶塞上棉花，并用报纸包好，拴上绳子。再用报纸包30套培养皿、30根竹签、试管等实验器皿。将上述材料放置于高压灭菌锅内进行灭菌，注意试管要直立放置。严格遵守高压灭菌锅的使用方法。（三）活化菌种并促其产孢将培养箱中培养的平板，接种环（针）、活化培养皿、酒精灯放在超净工作台。用接种环（针）挑取保存的菌种在平板上迅速划动，注意勿划破培养基，写好标签。做好后将活化平板倒置放在恒温培养箱中培养2448h。待菌株长出后，改变其培养环境，如将培养基放于冰箱一会再放回培养箱中，待其产孢后用加有少量吐温80的缓冲液或生理盐水洗平板内霉菌的孢子，制成孢子悬液,在磁力搅拌器下搅拌14分钟。则得到10-1的孢子悬液，再用移液枪汲取1ml10-1浓度的孢子液于9ml无菌水中，摇匀，即为10-2浓度样品，同法依次稀释到10-3，塞上塞子，写好编号、时间和样品名称。（四）、镜检取孢子悬液于载玻片上制成水侵片，在显微镜下观察是否为单孢子悬液，若发现孢子液不是单个的孢子，则可以在孢子液中加入适量的几丁质酶或蜗牛酶。（五）、计数（1）镜检计数板的计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗。1、用95酒精轻轻冲洗计数板的计数室。2、用蒸馏水清洗计数板，然后用吸水纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净。（2）加样品1、将洁净的盖片置于血球计数板的两条嵴上。2、用无菌滴管吸取少许摇匀的孢子液由盖玻片边缘滴一小滴，注意不宜加过多孢子液，加样前要摇匀菌液，加孢子液时不得使计数室内有气泡，两个平台上都滴加孢子液。3、让孢子液沿细缝靠毛细渗透作用自行渗入计数室，并充满计数室平台。计数加样后静置约5min后，将血球计数板置于显微镜镜台上，先用低倍镜找到计数室所在的位置，再转换成高倍镜进行计数。（3）、计算方法1、不同规格的计数板的计数方法有所差异。16 25规格的计数板，需要按对角线方位计算左上、左下、右上和右下4个中格（共100小格）的菌液；25 16规格的计数板，除统计上述4个中格外，还须统计中央一中格共5个中格（共80小格）的菌数。2、计数时当遇到位于中格线上的菌体时，一般只计数此中格上方及右方线上的菌体（或只计数此中格下方及左方线上的菌体）。3、若在计数前或计数时发现菌悬液太浓，需重新稀释后再计数。4、每一样品重复计数35次，取平均值。注意每次数值不应相差过大，否则重新操作。（4）清洗血球计数板使用完毕将血球计数板用流水清洗干净，切勿用硬物洗刷。洗完后自行晾干或用吹风机吹干，并镜检观察计数室内是否有残留菌体或其他沉淀物，若不干净，必须重复洗涤至干净为止。（六）诱变将每个梯度涂布的平板放在紫外灯管下30cm 处，开启紫外灯预热20min 后，打开皿盖，分别照射20、30、60、90、120s，取不同诱变处理菌液各1mL，用无菌高渗磷酸缓冲液稀释后，涂