《方法新技术》PPT课件.ppt

第十六章药物分析中的新技术 新方法 手性分离色谱 一 手性药物的现状 手性药物 579 药物 1992 天然和半合成药物 556 合成药物 1436 非手性药物 857 单一异构体 73 外消旋体 506 手性药物 547 非手性药物 9 单一异构体 537 外消旋体 10 二 手性药物对映体的药效学差异1 治疗作用完全依赖一种异构体如 S 甲基多巴2 药理作用差别不大如 异丙嗪3 药理作用类似 但反应强度有差别4 药理与毒理作用存在 质 的区别 二 手性药物对映体的药动学差异1 吸收2 蛋白结合3 代谢 1 间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法 CDR 2 直接法拆分对映异构体 手性固定相法 CSP 手性流动相添加剂法 CMP 三 手性药物拆分的高效液相色谱法分类 采用非手性固定相 四 拆分原理 1 CDR R SE R SA R SE R SA S SA R SE S SA 手性衍生化特点 需要高光学纯度的手性衍生化试剂 反应繁琐费时 衍生化反应速率重现性较差只需使用价格便宜 柱效较高的非手性柱衍生化过程可同时纯化样品 柱前衍生化 反相高效液相色谱法拆分酮洛芬对映异构体 S 酮洛芬R 酮洛芬 酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图 酮洛芬对映体的柱前衍生化方法 酮洛芬对照品溶液 1mg mL 0 1mL 加入正己烷0 6mL二氯亚砜溶液0 2mL 冷却至室温 吹干后加入S NEA溶液0 2mL 5min 振摇 加入2 0mol LH2SO40 5mL 混匀 吹干后溶解进样 色谱条件色谱柱 HypersilC18 5 m 150 5 0mmID 流动相 乙腈 水 乙酸 三乙胺 55 45 0 1 0 02 v v 流速 1ml min 检测波长 254nm 酮洛芬对映体衍生化物色谱图 R S 酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为tR 7 3min tR 8 5min 分离度为1 9 2 CSP 利用手性固定相与对映体消旋物相互作用 其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物 使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同 从而得到分离 常用的手性固定相 1 Pirkle型相2 合成多聚相3 环糊精键合相 特点 适用范围广制备分离方便定量分析的可靠性高价格昂贵 奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸 A 和苯丙氨酸 B 的p 溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱图 3 CMP 将手性试剂添加到流动相中 利用手性试剂与药物消旋物中各对映体结合的稳定常数不同 以及药物与结合物在固定相上分配的差异 实现对映体的分离 常用的手性添加剂 1 配基交换型手性添加剂2 手性离子对络合剂3 环糊精添加剂 特点 可采用普通的非手性固定相不需对样品进行衍生化手性添加物的可变范围较宽 高效毛细管电泳 HPCE HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速 高效的液相分离技术 具有以下特点 1 高效2 高速3 微量4 低消耗 毛细管电泳装置示意图 一 基本原理 v veo vep eo ep Eveo 电渗流速度 eo 电渗流淌度vep 电泳流速度 ep 电泳流淌度E 电场强度 电渗的产生 毛细电泳中不同组分的迁移示意图 二 主要分离模式1 毛细管区带电泳 CZE 2 胶束动电毛细管色谱 MECC 3 毛细管凝胶电泳 CGE 4 毛细管等电聚焦 CIEF 1 毛细管区带电泳最基本 最广泛的分离模式 适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离 但不能中性物质及质荷比相同的组分 2 胶束动电毛细管色谱用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液 使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离 采用手性分配相 可用于手性化合物的分离 3 毛细管凝胶电泳凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用 可分离质荷比相同但分子大小不同的组分 在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用 4 毛细管等电聚焦根据蛋白质的等电点不同而进行分离 pH梯度 高 低 应用 1 监测药物生产过程如 监测青霉素发酵液中有关物质的量 青霉素发酵液的高效毛细管电泳图1 青霉素G钠 2 6 APA 3 对羟基苯乙酸 4 邻羟基苯乙酸 5 苯乙酸 2 中药成分分析如 黄酮及其甙类分析 黄芩中6种黄酮类成分的胶束电动毛细管色谱分离图1 汉黄芩甙 2 黄芩素 3 黄芩甙 4 千层子素 5 汉黄芩素 6 内标水杨酸 7 白杨素 3 手性拆分4 体内分析 质谱法及其应用 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 控制和数据处理系统 真空系统 一 离子源及离子化技术1 EI 电子轰击离子化 电子轰击质谱示意图 优点 灵敏度高 有丰富的碎片离子信息和成熟的离子开裂理论 是结构分析 鉴定的有力手段 重现性好 有标准图谱 可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定 缺点 样品须汽化后才可离子化适用化合物 易挥发 热稳定化合物 2 CI 化学离子化 软电离技术优点 可以得到较强的准分子离子峰 有利于分子量的测定缺点 样品须汽化后才可离子化适用化合物 易挥发 热稳定化合物 3 FAB 快原子轰击离子化 软电离技术优点 样品不须汽化 既给出化合物的分子量信息 又给出结构信息 适用范围广 仪器商品化较早 普及率高 缺点 重现性差 灵敏度较EI低 适用化合物 极性 高分子量 非挥发性及热不稳定化合物 快原子枪 样品靶 原子束 质量分析器 二次离子束 快原子轰击质谱示意图 4 MALDI 基质辅助激光解吸离子化 软电离技术优点 通常只给出分子离子峰 或准分子离子峰 适用化合物 蛋白质 多肽 寡核苷酸等生物大分子 5 API 大气压离子化 软电离技术 1 ESI 电喷雾离子化 特点 能够产生多电荷离子 适用化合物 对生物大分子及其他分子量大的化合物的分析较有利 毛细管 4kV 含离子的液滴 随液滴蒸发 电场加强 离子向表面移动 离子从表面蒸发 离子蒸发机理 2 APCI 大气压化学离子化 最软的电离方式之一特点 一般只给出化合物的分子量信息 通过源内CID 碰撞诱导分解 可同时获得结构信息 适用