基于ISSR标记的江西野生寒兰居群遗传多样性研究

园艺学报 2017 44 10 1993 2000 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2016 0889 http www ahs ac cn 1993 收稿日期 收稿日期 2017 08 07 修回日期 修回日期 2017 10 18 基金项目 基金项目 国家自然科学基金项目 31260485 通信作者 Author for correspondence E mail jxxdj yangboyun 基于ISSR标记的江西野生寒兰居群遗传多样性 研究 江亚雯 孙小琴 罗火林 杨柏云 熊冬金 南昌大学生命科学学院 江西省植物资源重点实验室 南昌 330031 摘 要 摘 要 采用 ISSR 分子标记对江西省主要山脉 12 个野生寒兰居群共 185 个体进行遗传多样性和群 体遗传结构研究 结果表明 12 条 ISSR 引物共扩增出 123 个条带 其中多态性条带 97 个 多态性条带 百分率 PPB 为 78 9 12 个寒兰居群在物种水平上的遗传多样性较高 群体总观测等位基因数 Na 为 1 7967 有效等位基因数 Ne 为 1 4461 Nei s 基因多样性 He 为 0 2649 Shannon s 信息多样性 指数 I 为 0 3995 在居群水平上遗传多样性较低 PPB 平均值为 43 97 Na平均值为 1 4397 Ne平均 值为 1 2478 He平均值为 0 1462 I 平均值为 0 2204 遗传分化系数 GST 为 0 4415 居群间基因流 Nm 为 0 6325 表明居群内的遗传分化大于居群间的遗传分化 UPGMA 聚类结果显示 12 个寒兰居群可聚为 两支 第一支由资溪 武夷山大叶 武夷山小叶 崇义小叶 靖安 宜丰 井冈山 邵武大叶和邵武小 叶 9 个居群组成 第二支由石城 安远和崇义大叶 3 个居群组成 聚类结果没有呈现出山脉分布的特点 Mantel 检验结果表明遗传距离和地理距离之间无显著相关性 r 0 3791 关键词 关键词 寒兰 ISSR 遗传多样性 遗传结构 中图分类号 中图分类号 S 682 31 文献标志码 文献标志码 A 文章编号 文章编号 0513 353X 2017 10 1993 08 Studies on Genetic Diversity of Cymbidium kanran Populations from the Main Mountains in Jiangxi Province Based on ISSR Marker JIANG Yawen SUN Xiaoqin LUO Huolin YANG Boyun and XIONG Dongjin School of Life Sciences Nanchang University Key Laboratory of Plant Resources in Jiangxi Province Nanchang 330031 China Abstract This study used ISSR molecular marker to analyze the genetic diversity and genetic structure of 12 Cymbidium kanran populations from the main mountains in Jiangxi Province The results showed that 123 bands were amplified from 185 individuals from 12 primers of which 97 bands were polymorphic the percentage of polymorphic bands was 78 9 The genetic diversity of 12 populations at species level was higher PPB 78 9 Na 1 7967 Ne 1 4461 He 0 2649 I 0 3995 while the genetic diversity at population level was lower PPB 43 97 Na 1 4397 Ne 1 2478 He 0 1462 I 0 2204 The genetic differentiation coefficient GST was 0 4415 gene flow Nm was 0 6325 these indicated that the genetic differentiation in the populations was higher than the genetic differentiation among the populations Jiang Yawen Sun Xiaoqin Luo Huolin Yang Boyun Xiong Dongjin Studies on genetic diversity of Cymbidium kanran populations from the main mountains in Jiangxi Province based on ISSR marker 1994 Acta Horticulturae Sinica 2017 44 10 1993 2000 Based on cluster analysis by UPGMA 12 C kanran populations were classified into two groups the first group included nine populations of ZX WYS WYSX CYX JA YF JGS SW and SWX the second group included three populations of SC AY and CY the result of cluster analysis showed no obvious correlation with the distribution of C kanran populations according to the mountains Mantel test showed that there was no significant correlation between genetic distance and geographical distance r 0 3791 Keywords Cymbidium kanran ISSR genetic diversity genetic structure 寒兰 Cymbidium kanran 是兰科 Orchidaceae 兰属 Cymbidium 多年生草本植物 多生长 于海拔 400 2 400 m 的林下或溪谷旁 具有很高的经济价值 在中国主要分布于福建 江西 广西 贵州 云南 四川等地 陈心启和吉占和 2003 寒兰又可以其花瓣 特别是捧瓣 是否带有覆轮 舌瓣的底色是否为白色分为大叶寒兰和小叶寒兰 江西省境内的九岭山脉 九连山脉 罗霄山脉和 武夷山脉等地的生态环境十分适宜寒兰生长 野生寒兰资源十分丰富 近年来 由于人为采挖以及 生境的破碎化 导致寒兰居群片断化严重 DNA 分子标记是研究植物遗传多样性的有效技术 张征 锋 等 2009 ISSR 标记结合了 RAPD 和 SSR 标记技术的优点 Zietkiewicz et al 1994 具有 DNA 用量少 试验成本低 稳定性好和多态性丰富等优点 广泛应用于兰科植物的遗传多样性研究 如蝴蝶兰 谢启鑫 等 2010 春兰 高丽和杨波 2006 硬叶兜兰 李宗艳 等 2016 等 寒 兰资源研究方面 徐晓薇等 2011 用 SSR 标记对 37 个寒兰株系进行了遗传多样性与亲缘关系的 研究 蹇黎和朱利泉 2010 利用 SRAP 分子标记对 37 个中国寒兰和 14 个日本寒兰进行了遗传多 样性和亲缘关系的研究 沈峥华等 2010 等对贵州寒兰资源进行了科学考察并提出了保育措施 Jian 和 Zhu 等 2013 利用 PCR RFLP 标记对 54 个中国 日本和韩国的寒兰品种进行了遗传多样 性的研究 段艳皊等 2014 对 35 份寒兰的 38 个表型性状进行了多样性分析 目前对寒兰自然居 群遗传多样性与遗传结构方面的研究报道较少 本研究中在调查江西野生寒兰资源分布状况的基础 上 利用 ISSR 分子标记对江西 12 个寒兰居群的 185 个样本进行遗传多样性分析 以期了解江西野 生寒兰遗传多样性水平与居群遗传结构特点 为寒兰资源保护提供科学合理的依据 1 材料与方法 试验样品主要采自于江西省各地以及福建省的武夷山市和邵武市 采样地分布于武夷山脉 罗 霄山脉 九岭山脉和九连山脉 表 1 为避免对当地野生寒兰居群造成不可恢复的破坏 2011 年在 每个采样地分散采样 并且在直径 50 m 范围内只采 1 株样本 每株采取少量新鲜幼嫩的叶片 于 80 冰箱保存 采用改良的 CTAB 液氮法提取寒兰基因组 DNA 用 1 0 琼脂糖电泳检测 DNA 的完整性 再 用分光光度计测定其纯度和浓度 并将浓度稀释至 30 ng L 1 样品于 20 保存备用 PCR 反应体系总体积 25 L 其中 2 5 L 10 PCR buffer 2 0 mmol L 1 MgCl2 200 mol L 1 dNTPs 1 4 U Taq DNA 聚合酶 0 4 mol L 1引物 100 ng 模板 DNA PCR 反应程序为 94 预 变性 5 min 94 变性 45 s 50 58 2 退火 45 s 72 延伸 80 s 共 35 个循环 72 延伸 8 min 最后于 4 保存 引物参照哥伦比亚大学公布的序列 UBC801 UBC900 http www biotech ubc ca services naps primers Primers pdf 由生工生物工程 上海 股份有限公司合成 优化反应 体系对引物进行筛选 筛选出条带清晰丰富 多态性较好的引物用于 PCR 扩增 江亚雯 孙小琴 罗火林 杨柏云 熊冬金 基于 ISSR 标记的江西野生寒兰居群遗传多样性研究 园艺学报 2017 44 10 1993 2000 1995 PCR 产物经 1 5 琼脂糖凝胶电泳检测 以 DL2000 大连宝生物有限公司 为分子量对照 在 100 V 稳压 5 V cm 1 的条件下电泳 1 h 左右 电泳完毕后在紫外自动成像仪下观察并拍照保存 以清晰且可重复为基本原则 按照同一位置上扩增产物条带的有无进行统计 有条带的记为 1 无 条带的记为 0 对每一引物扩增结果建立二元数据矩阵 利用 POPGENE 1 32 软件 Yeh et al 1997 在假定居群处于 Hardy Weinberg 平衡状态下计算各项遗传多样性指数 多态位点百分率 PPB 有效等位基因数 Ne Nei s 基因多样性 He Shannon s 信息指数 I 种群总基因多样性 HT 种群内的基因多样性 HS 基因流水平 Nm Nei s 1978 遗传距离 D 和遗传一致度 I 利用 AMOVA PREP 1 01 Miller 1998 和 WINAMOVA 1 55 软件进一步分析寒兰居群内及居群间 的遗传分化水平 ST 根据 Nei s 遗传距离 利用 NTSYS PC 2 0 软件对居群进行 UPGMA 聚类分 析 构建聚类图 各居群的遗传距离和地理距离间的相关性分析通过软件 TFPGA 1 3 Miller 1997 统计得出 表表 1 寒兰材料来源寒兰材料来源 Table 1 The source of C kanran material 叶片类型 Leaf type 居群编号 Population code 采样地 Locality 山脉 Mountains 经度 Longitude 纬度 Latitude 海拔 m Altitude 采样数 Sample size YF 宜丰 Yifeng 九岭山脉 Jiuling Mountains 114 3 114 5 E 28 0 28 1 N 470 680 19 JA 靖安 Jing an 九岭山脉 Jiuling Mountains 115 0 115 1 E 28 2 28 5 N 660 810 10 AY 安远 Anyuan 九连山脉 Jiulian Mountains 115 2 115 5 E 25 1 25 5 N 520 610 11 CY 崇义 Chongyi 罗霄山脉 Luoxiao Mountains 114 0 115 0 E 25 4 26 1 N 410 540 10 JGS 井冈山 Jinggangshan 罗霄山脉 Luoxiao Mountains 114 0 115 2 E 26 3 27 1 N 700 830 12 SC 石城 Shicheng 武夷山脉 Wuyi Mountains 116 1 117 0 E 26 0 26 5 N 390 630 18 WYS 武夷山 Wuyishan 武夷山脉 Wuyi Mountains 117 0 117 5 E 27 5 28 2 N 710 930 20 ZX 资溪 Zixi 武夷山脉 Wuyi Mountains 117 0 117 3 E 27 4 27 5 N 690 710 20 大叶寒兰 Daye C kanran SW 邵武 Shaowu 武夷山脉 Wuyi Mountains 117 1 117 5 E 27 0 27 4 N 580 700 18 小叶寒兰 WYSX 武夷山 Wuyishan 武夷山脉 Wuyi Mountains 116 1 117 5 E 27 5 28 2 N 710 930 20 Xiaoye C SWX 邵武 Shaowu 武夷山脉 Wuyi Mountains 117 1 117 5 E 27 0 27 4 N 580 700 17 kanran CYX 崇义 Chongyi 罗霄山脉 Luoxiao Mountains 114 0 115 0 E 25 4 26 1 N 410 540 10 2 结果与分析 2 1 种水平遗传多样性分析 利用 ISSR 分子标记对江西省主要山脉 12 个野生寒兰居群共 185 个体分析表明 12 个引物共扩 增出 123 个条带 其中多态性条带共 97 个 PPB 为 78 9 条带分子量大小为 300 2 000 bp 每 个引物扩增出的条带在 7 14 个之间 平均 10 3 个 每个引物扩增出的多态性条带在 2 14 个之间 平均 8 1 个 平均 PPB 为 75 70 表 2 Nei s 基因多样性指数 He 为 0 2649 Shannon s 信息多 样性指数 I 为 0 3995 表 3 图 1 为引物 UBC835 对部分样品扩增的电泳图谱 12 对引物的扩 增结果表明野生寒兰群体具有较高的遗传多样性 ISSR 分子标记能有效地揭示 12 个寒兰居群的遗 传多态性 Jiang Yawen Sun Xiaoqin Luo Huolin Yang Boyun Xiong Dongjin Studies on genetic diversity of Cymbidium kanran populations from the main mountains in Jiangxi Province based on ISSR marker 1996 Acta Horticulturae Sinica 2017 44 10 1993 2000 表表 2 用于本试验的用于本试验的 ISSR 引物及其扩增结果引物及其扩增结果 Table 2 ISSR primers used in this study and their amplification results 引物 Primer 碱基序列 Sequence 退火温度 Annealing temperature 扩增条带数 Number of amplified bands 多态性条带数 Number of polymorphic bands 多态性百分率 PPB UBC807 AG 8T 58 2 14 14 100 00 UBC811 GA 8C 58 2 11 11 100 00 UBC812 GA 8A 50 0 11 11 100 00 UBC822 TC 8A 52 0 12 11 91 67 UBC825 AC 8T 55 2 13 12 92 31 UBC835 AG 8YC 56 9 8 7 87 50 UBC836 AG 8YA 52 0 8 6 75 00 UBC841 GA 8YC 59 1 11 5 45 45 UBC855 AC 8YT 52 0 8 4 50 00 UBC860 TG 8RA 50 0 8 5 62 50 UBC868 GAA 6 51 4 12 9 75 00 ISSR 6 DBD GA 7 52 0 7 2 28 57 总计 Total 123 97 平均 Average 10 3 8 1 75 70 注 表中 R 代表 A 或 T Y 代表 C 或 G Note R represents A T Y represents C G 图图 1 引物引物 UBC835 与部分样本的扩增结果与部分样本的扩增结果 Fig 1 The amplification result of primer UBC835 for part of the samples 2 2 居群间遗传多样性分析 利用 POPGENE 1 31 软件对 12 个寒兰居群进行遗传多样性指数分析 结果如表 3 所示 寒兰在 总的水平上的多态位点百分率 PPB 为 78 9 等位基因数 Na 为 1 7967 有效等位基因数 Ne 为 1 4461 12 个居群的多态位点百分率 PPB 在 27 64 52 85 之间 平均为 43 97 等位基 因数 Na 在 1 2764 1 5285 之间 平均为 1 4397 有效等位基因数 Ne 在 1 1265 1 2917 之间 平均为 1 2478 Nei s 基因多样性指数 He 在 0 0778 0 1732 之间 平均为 0 1462 Shannon s 信 息多样性指数 I 在 0 1213 0 2622 之间 平均为 0 2204 其中遗传多样性水平最高的为武夷山小 叶寒兰居群 WYSX PPB 52 85 He 0 1732 I 0 2622 而崇义小叶寒兰居群 CYX 的遗传多样性水平最低 PPB 27 64 He 0 0778 I 0 1213 利用 POPGENE 1 31 软件 假设 Hardy Weinberg 遗传平衡 计算寒兰不同居群间的遗传分化水 平 结果表明 12 个居群总的遗传变异 HT 为 0 2617 居群内的遗传变异 HS 为 0 1462 居群 间的遗传分化系数 GST 为 0 4415 居群内变异高于居群间的变异 居群间的基因流水平 Nm 为 0 6325 小于 1 表明居群间的基因交流程度有限 进一步用 AMOVA 分析的结果 表 4 显示 FST值为 0 2881 表明在总的遗传变异中有 28 81 江亚雯 孙小琴 罗火林 杨柏云 熊冬金 基于 ISSR 标记的江西野生寒兰居群遗传多样性研究 园艺学报 2017 44 10 1993 2000 1997 发生在居群间 71 19 存在于居群内 居群内和居群间的差异均极显著 P 0 001 AMOVA 分 析结果与 POPGENE 分析结果大体一致 两种方法均表明各居群的遗传变异主要存在于居群内 表表 3 寒兰寒兰 12 个居群个居群 ISSR 遗传多样性比较分析遗传多样性比较分析 Table 3 Statistical analysis of genetic variation for 12 populations of C Kanran based on ISSR data 居群编号 Population code 个体数 Number of sample 多态位点数 Number of polymorphic band 多态位点 百分率 PPB 等位基因数 Na 有效等位 基因数 Ne Nei s 基因 多样性 He Shannon s 信息 多样性指数 I YF 19 58 47 15 1 4715 1 2820 0 1640 0 2448 JA 10 42 34 15 1 3415 1 1987 0 1202 0 1814 JGS 12 59 47 97 1 4797 1 2877 0 1645 0 2456 ZX 20 63 51 22 1 5122 1 2878 0 1678 0 2523 SC 18 56 45 53 1 4553 1 2917 0 1658 0 2452 WYS 20 61 49 59 1 4959 1 2553 0 1558 0 2386 SW 18 61 49 59 1 4959 1 2492 0 1524 0 2335 AY 11 53 43 09 1 4309 1 2442 0 1447 0 2180 CY 10 35 28 46 1 2846 1 1864 0 1059 0 1567 CYX 10 34 27 64 1 2764 1 1265 0 0778 0 1213 WYSX 20 65 52 85 1 5285 1 2875 0 1732 0 2622 SWX 17 62 50 41 1 5041 1 2769 0 1623 0 2449 平均 Average 15 54 43 97 1 4397 1 2478 0 1462 0 2204 物种水平 Species level 185 97 78 90 1 7967 1 4461 0 2649 0 3995 表表 4 寒兰居群间与居群内的遗传变异分析寒兰居群间与居群内的遗传变异分析 Table 4 Analysis of molecular variance AMOVA among and within C Kanran populations 变异来源 Source of variation 自由度 d f 均方差 Sum of square 均方值 Mean square 变异组分 Variance component 变异组分百分比 Percent of total variance 居群间 Among populations 11 174 21 15 84 0 89 28 81 居群内 Within populations 173 380 71 2 20 2 20 71 19 2 3 寒兰的遗传距离和聚类分析 利用 POPGENE1 31 软件计算 Nei s 遗传距离 D 和遗传一致度 I 结果如表 5 所示 寒兰 12 个居群两两之间的遗传一致度 I 在 0 7816 0 9172 之间 遗传距离 D 在 0 0865 0 2464 之间 其中石城 SC 和靖安 JA 的两个居群之间的遗传距离最大 为 0 2464 宜丰 YF 和 井冈山 JGS 两个居群的遗传距离最小 为 0 0865 从表 5 可知 邵武大 小叶 崇义大 小叶 武夷山大 小叶居群遗传距离分别为 0 1099 0 1049 0 1005 遗传一致度 0 8959 0 9004 0 9044 表明同一个来源地的大 小叶寒兰居群间遗传背景较一致 基于 Nei s 遗传距离将 12 个居群聚为 2 大类 图 2 地理位置较近居群基本上聚为一类 赣南 地区的石城 SC 安远 AY 和崇义大叶 CY 3 个居群聚为一大类 其他 9 个居群为一大类 后者细分为 3 小类 邵武地区 2 个居群为一类 资溪 武夷山和崇义小叶 CYX 为一类 井冈山 宜丰和靖安为一类 其中也有些例外的情况 邵武和资溪 武夷山地理位置较近 但邵武另聚一类 可能是三地分别位于武夷山顶峰黄岗山 华东最高峰 西 东及南三面 三地生态环境及气候有些 差别等原因导致 从聚类图中还可以看出 武夷山大叶 WYS 和武夷山小叶 WYSX 邵武大叶 SW 和 邵武小叶 SWX 居群分别聚在一起 仅崇义大叶 CY 和崇义小叶 CYX 居群没有聚在一起 这表明同一个来源地的大 小叶寒兰居群间遗传差异不明显 利用 TFPGA 1 3 软件对寒兰各个居群之间的遗传距离和地理距离进行 Mantel 统计分析 并做 显著性检验 随机检测 1 000 次 结果表明寒兰居群间的遗传距离和地理距离之间无显著相关性 r 0 3791 P 0 0090 表明地理隔离在高水平遗传分化上没有明显作用 Jiang Yawen Sun Xiaoqin Luo Huolin Yang Boyun Xiong Dongjin Studies on genetic diversity of Cymbidium kanran populations from the main mountains in Jiangxi Province based on ISSR marker 1998 Acta Horticulturae Sinica 2017 44 10 1993 2000 表表 5 Nei s 遗传一致度 遗传一致度 I 右上角 和遗传距离 右上角 和遗传距离 D 左下角 左下角 Table 5 Nei s genetic identity I above diagonal and genetic distance D below diagonal POP ID YF JA JGS ZX SC WYS SW AY CY CYX WYSX SWX YF 0 87770 9172 0 8842 0 8132 0 8662 0 8272 0 8231 0 8239 0 8219 0 8770 0 8444 JA 0 1305 0 8712 0 8636 0 7816 0 8865 0 8457 0 7980 0 8038 0 8242 0 8637 0 8385 JGS 0 0865 0 1379 0 8760 0 8538 0 8709 0 8399 0 8335 0 8364 0 8324 0 8713 0 8576 ZX 0 1231 0 14660 1323 0 8203 0 9090 0 8544 0 8418 0 8483 0 8710 0 8925 0 8407 SC 0 2068 0 24640 1793 0 1981 0 8178 0 8199 0 8856 0 8722 0 8377 0 8205 0 8332 WYS 0 1436 0 12050 1383 0 0954 0 2012 0 8495 0 8107 0 8426 0 8814 0 9044 0 8568 SW 0 1897 0 16760 1745 0 1573 0 1986 0 1632 0 8465 0 8327 0 8572 0 8614 0 8959 AY 0 1946 0 22560 1822 0 1722 0 1215 0 2098 0 1666 0 9132 0 8442 0 8343 0 8727 CY 0 1937 0 21840 1786 0 1645 0 1368 0 1712 0 1830 0 0908 0 9004 0 8582 0 8541 CYX 0 1961 0 19330 1835 0 1381 0 1771 0 1263 0 1540 0 1693 0 1049 0 8758 0 8614 WYSX 0 1313 0 14650 1378 0 1138 0 1978 0 1005 0 1492 0 1812 0 1529 0 1326 0 8492 SWX 0 1691 0 17610 1537 0 1736 0 1825 0 1545 0 1099 0 1362 0 1577 0 1492 0 1634 图 图 2 寒兰寒兰 12 个居群个居群 UPGMA 聚类图聚类图 Fig 2 UPGMA dendrogram of twelve C kanran populations based on genetic distance 3 讨论 3 1 寒兰的遗传多样性 Ayala 和 Kiger 1984 和 Nybom 和 Igor 2004 分别利用等位酶标记和 SSR 分子标记研究发 现 自花授粉与异花授粉物种间在遗传多样性上平均相差 3 倍左右 杂合率显著高于自交群体 张 德全和杨永平 2008 分析发现 有性生殖植物中异交植物遗传多样性最高 自交植物最低 广布 种的遗传多样性明显高于濒危和狭域分布种 寒兰为多年生草本植物 在中国 日本及朝鲜半岛等 地均有分布 陈心启和吉占和 2003 本研究中寒兰整体遗传多样性水平 He 0 2649 和春兰 He 0 2628 高丽和杨波 2006 接近 寒兰与春兰同属于建兰亚属建兰组 二者都属于广布种 分布区域较接近 两者遗传多样性水平也较为接近 另一原因是寒兰为兼性繁殖 陈心启 1988 认为寒兰是异花授粉植物 其花部结构与昆虫传粉高度适应兰花 寒兰是通过有性繁殖产生杂合种 子 种子遇到较适宜条件 如真菌的帮助 才能萌发 杂合种子成活率相当低 成活的子代经多年 生长成株后 依靠假鳞茎行无性繁殖将这些杂合基因位点固定下来并维持其丰富的遗传多样性 寒 兰形态丰富多样 表现出极高的多样性 从植株高矮到叶色 叶形 花色 瓣形等都表现出丰富的 变异 唇瓣差异也大 春 夏 秋三季都可开花 这些变异在居群间和居群内都同样存在 另外植 物体细胞突变也是导致寒兰居群内遗传变异丰富主要原因之一 康明和黄宏文 2002 认为植物有 性生殖非常缺乏时 体细胞突变可能是主导遗传变异的一个主要因素 江亚雯 孙小琴 罗火林 杨柏云 熊冬金 基于 ISSR 标记的江西野生寒兰居群遗传多样性研究 园艺学报 2017 44 10 1993 2000 1999 3 2 寒兰居群间的遗传分化 植物群体遗传结构受交配方式影响 自交 近交 的物种遗传多样性主要存在于种群间 异交 物种则以种群内为主 Silva et al 2003 Bussell 1999 对 35 个物种的 RAPD 分析表明 29 个 远交物种平均 GST为 0 193 6 个近交物种的平均 GST为 0 625 基因流 Nm 是影响遗传分化的重 要因素 一般认为 Nm 1 阻止遗传漂变产生遗传分化 Nm 1 居群间基因交流较少 遗传漂变 是遗传分化的主要因素 Wright 1931 本研究中寒兰居群间的 GST为 0 4415 Nm为 0 6325 居 群内变异占总变异的 71 19 说明寒兰是以异交为主的混交类群 高丽和杨波 2006 对 12 个湖北春兰野生居群 ISSR 标记分析结果表明 GST为 0 2440 Nm为 0 8828 居群内变异占总变异的 77 93 认为湖北春兰遗传分化程度较高 主要原因有三方面 1 空间隔离和缺乏有效新个体的迁入 2 生境片断化 3 遗传漂变 尽管寒兰和春兰是不同的种 但两者亲缘关系较近 与春兰相比 江西寒兰居群间的遗传分化程度更为严重 居群间的基因流是 借助于花粉 种子等携带遗传物质进行的 花粉和种子扩散是自然界植物种群最主要的基因流 李 海生和陈桂珠 2004 江西山脉较多 地理隔离造成花粉和种子不易扩散 另外 人为滥采滥挖造 成的生境破坏和居群片断化也是其原因之一 3 3 野生寒兰资源的保护 生物多样性保护最终是保护遗传多样性 王洪新和胡志昂 1996 本研究中发现 寒兰尽管 在总的水平上的遗传多样性较高 但居群间遗传分化程度低 这主要是因为近年来人们的乱采滥挖 使得野生寒兰资源受到严重破坏 从而造成居群片断化严重 针对这一现状 结合寒兰遗传多样性 及遗传结构特点 提出以下几点保护策略 1 对现有的野生寒兰资源进行就地保护 禁止乱采滥 挖 建立保护区 2 加大人工引种繁育力度 尽快恢复寒兰的居群规模 3 加大科研力度 探 索出更好的方法来扩大种群数量及居群规模 并在此基础上培育优良品种 从而满足市场需求 最 终实现寒兰资源的可持续利用 4 兰花依靠虫媒传粉 大多数兰花离开传粉者是无法长久世代相 传的 因此在保护寒兰的同时 还应对其传粉者进行保护 从而更好地保护寒兰的遗传多样性 References Ayala F J Kiger J A Jr 1984 Modern genetics 2nd ed Menlo Park and London Benjamin 923 924 Bussell 1999 The distribution of random amplified polymorphic DNA RAPD diversity amongst populations of Isotoma petraea Lobeliaceae Molecular Ecology 8 5 775 789 Chen Xin qi 1988 Orchid and insect 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