《核酸体外扩增》PPT课件.ppt

第十一章核酸体外扩增 本章讨论3个问题 什么是核酸体外扩增 为什么能进行核酸体外扩增 怎样进行核酸体外扩增 为了便于大家理解 我们先介绍几个相关问题 1 体内DNA复制体外酶促基因 DNA 扩增 1 模板ds ssds 热变性 ss 2 酶DDDP II 耐热的Taq酶有3 5 外切酶活性有5 3 外切酶活性5 3 外切酶活性无3 5 外切酶活性 3 引物RNADNA 4 dNTP 5 Mg2 6 反应缓冲体系 7 反应温度37 94 55 70 72 核酸体内扩增和核酸体外扩增 2 PCR引物相关概念 A B a b 5 3 5 3 引物a与A链一致 在5 端 与B链互补 所以 a为 上游引物3 端引物反义引物左侧引物向前合成引物 反之b为 下游引物5 端引物正义引物右侧引物向后合成引物 3 为什么要进行PCR 为了获得基因诊断的材料 进行基因定量 表达异常 和进行基因定性 结构异常 以及获取研究的材料 PCR 所谓PCR 又称体外酶促基因扩增 是利用DNA聚合酶依赖DNA模板的特征 模仿体内DNA的复制过程 在附加的一对引物之间诱导的聚合酶反应 基本原理 在模板 引物 4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下 特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应 第一节聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 一 PCR的基本原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法 其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的 所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸 其本质是ssDNA片段 待扩增DNA模板加热变性后 两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性 此时两引物3 端相对 5 端相背 在合适条件下 由Taq 或其他 DNA聚合酶催化引物引导的DNA合成 即引物的延伸 上述过程是由温度控制的 这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 图11 1 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 延伸产物经第二循环变性后 亦与引物互补 作为引物引导DNA合成的新模板 因此 第二循环后 延伸的模板由第一循环的4条增加为8条 包括原始模板在内 依此类推 以后每一循环后的模板均比前一模板增加一倍 理论上 扩增DNA的产量是指数上升的 即n个循环后 产量为2n拷贝 图11 1明显指明了扩增片段的末端是由两引物5 端限定的 1 高温 变性 94 denaturation 在摩尔数大大过量的两段寡核苷酸及4种dNTP参入下 对模板DNA进行加热变性 通过加热使DNA双螺旋氢键断裂 双链解离形成单链DNA denaturation 2 低温 退火 55 annealling 将反应混合液冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 当温度突然降低时 由于模板分子结构较引物要复杂得多 而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA 使引物与其互补模板在局部形成杂交链 而模板双链之间互补的机会较少 3 中温 延伸 70 72 extension 在底物4种dNTP及Mg2 存在的条件下 DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链按5 3 方向进行延伸反应 以上3步为一个循环 在PCR仪 或手动PCR 作用下 如此反复进行变性 退火和延伸循环 从而使产物迅速得到扩增 几十轮反应仅需数小时 介于两个引物之间的特异性DNA片段可得到大量复制 数量可过2 106 2 107拷贝 有人将这一过程描述成 高温变性 低温退火 中温延伸 cycle cycle PCR是3个反应的有序组合和循环 基本步骤 变性 加热使双链DNA变为单链退火 降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸 耐热DNA聚合酶按5 3 方向催化以引物为起始点的延伸反应 PCR的基本原理示意图 二 PCR引物设计原则 在PCR反应中使用的耐热Taq 或其他 DNA聚合酶 相应的缓冲体系及dNTP 核苷三磷酸 已经商品化 可从相应公司购买现成待用的 但有两个关键成份是有待研究人员准备的 第一个是核酸模板 我们放在引物设计原则之后讨论 不能有污染 不能有聚合酶抑制剂 第二个是寡核苷酸引物的选择 通常是整个扩增反应成败的关键 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段 使其有效扩增模板DNA序列 引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否 对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保成功 但遵循下述原则 则有助于引物的设计 1 待扩增片段必须是已知的 至少2个引物互补序列是已知的 在片断两侧确定引物序列 2 引物长度一般为15 30个核苷酸 可以据需要设计的更长一些 但至多到50个核苷酸左右 注 引物的有效长度Ln 2 G C A T Ln值不能大于38 否则 最适延伸温度会超过Taq聚合酶最适温度 不能保证产物的特异性 3 碱基的随机分布引物中4种碱基分布最好是随机的 避免出现嘌呤嘧啶堆积现象 G C含量为40 60 注 Tm值是寡核苷酸的解链温度 即在一定的盐浓度条件下 50 寡核苷酸双链解链温度 有效启动温度 Tp 一般高于Tm值5 10 若按公式Tm 4 G C 2 A T 估计引物Tm值 则有效引物Tm为55 80 其Tm值最好接近72 以便复性条件最佳 4 引物自身和引物之间引物自身不应存在互补序列 避免引物自身成发卡结构或引物本身复性 这种二级结构会因空间位阻效应影响引物与模板复性结合 若人工判断 引物自身连续互补碱基不能大于3bp 引物之间不应有互补性 尤应避免互补重叠 以防引物二聚体的形成 一对引物间不应多于4个碱基的同源性或互补性 5 引物的3 端与模板DNA一定要配对 引物的延伸是从3 端开始的 不能进行任何修饰 有资料表明3 端末位碱基在很大程度上影响Taq酶延伸效率 当末位为A时 即使错配 也能引发链的合成 A A错配使产量下降至1 20 A G和C C错配下降至1 100 而末位为T时 错配引发效率会大大降低 因G或C居中间 所以3 端末位碱基最好选T C或G 而不选A 6 引物的5 端5 端界定着PCR产物的长度 它对扩增特异性影响不大 末端碱基无严格限制 甚至可不与DNA模板匹配呈游离状态 但末端碱基最好是G或C 3对氢键 使PCR产物的末端结合稳定 7 引物5 端修饰引物与模板结合时 最多可以游离十几个碱基而不影响PCR扩增的特异性 因此 5 端可以被修饰 引物5 端修饰包括 1 引入酶切位点 可使PCR产物克隆效率更高 2 引入突变位点 起始密码子或终止密码子 3 标记生物素 地高辛 荧光素等 4 使用T4噬菌体多核苷酸激酶使末端为平端的PCR产物使其磷酸化克隆到通用载体上 8 引物中引入酶切位点注意5 端上游不应少于3个核苷酸 否则切不开 有些酶 如Hind 至少需要7个核苷酸 5 GGGTGACAAGCTT3 如有可能 最好把位点放在引物的中间 将引物设计为25 30个核苷酸 PCR引物设计原则要点1 长度为15 30个核苷酸2 碱基随机分布 G C的含量为45 55 3 避免发夹结构的形成 引物的存在连续互补序列不超过3bp4 引物之间不应存在互补序列 避免3 端互补重叠5 引物的碱基序列与非扩增区域无同源性6 引物3 端碱基一定与模板配对 最佳碱基选G和C7 引物5 端可以修饰 如加酶切位点 突变位点 起始密码子 终止密码子等 三 模板制备 模板的取材主要依据PCR扩增对象及各学科的专业知识而定 模板 或PCR的标本 经适当处理方可使用 因为处理 1 使待扩增DNA暴露 能与引物复性 2 去除抑制TaqDNA聚合酶杂质 在制备RNA模板时要防止RNA降解 一 DNA模板制备1 去垢剂破坏细胞 除杂质 乙醇沉淀核酸2 水煮沸溶解细胞3 要求并不严格4 模板用量低 哺乳动物基因组DNA1 g 质粒DNA0 1ng 二 RNA模板的制备1 RNA提取试剂盒2 酸性硫氰酸胍 酚 氯仿法3 异硫胍氯化铯密度梯度分离法4 SDS 酚 氯仿法 三 模板的取材模板 PCR样本 可来源于病原微生物 组织细胞 血迹精斑 羊水尿样等 关于模板DNA或RNA制备请参看实验讲义 1 病原体标本 病毒 细菌 真菌 螺旋体 立克次体 支原体等2 病理生理标本 细胞 血液 绒毛 尿液等3 法医学标本 血斑 精斑 毛发4 考古标本 四 PCR的基本反应 在此处仅列出一般PCR操作过程 具体各种影响因素的优化 PCR反应条件的控制 将在下面讨论 每一具体操作前都要进行必要的优化 一 以DNA为模板的反应 反应体积 50 100 l缓冲液引物底物 4种dNTP模板 102 105拷贝TaqDNA聚合酶矿物油 50mmol Lkcl10mmol LTrisHclmmol L 室温PH8 3 1 5mmol LMgcl2100 g明胶或BSA引物1 2各0 25 mol4种底物 dATP dCTP dGTP dTTP 各200 mol模板DNA0 1 gTaq聚合酶2 5单位模板DNA的用量需根据分子的大小加以调整 一般需含102 105拷贝的DNA 封上矿物油 防止高温反应时液体挥发 以防污染 反应条件94 变性30s 55 退火30s 70 72 延伸30 60s 共进行30次左右的循环 1 标准的PCR 反应体积50 100 l 2 按实习讲义操作PCR 1 按以下顺序 将各成分在0 5ml无菌离心管混合 无菌水30 l10 Buffer10 l4种dNTP 每种浓度为1 25mmol L16 l引物1 5pmol l 5 l引物2 5pmol l 5 l模板DNA0 1 1 0 g l加水至终体积100 l2 将溶液混匀 15000rpm10s 3 95 加热混合液7分钟 使DNA完全变性 4 将0 5 l 2 5单位 Taq酶加入混合液中 也有先加酶 5 封上矿物油100 l 6 按下述条件PCR 循环变性退火聚合首轮循环94 5Min50 1Min72 1Min后续循环94 1Min50 1Min72 1Min末轮循环94 1Min50 1Min72 7Min7 末轮循环后不再变性 15000rpm2Min 将反应转入另一小管中 20 保存 8 从反应物取出扩增DNA凝胶电泳 southern杂交或测序分析 二 以mRNA为模板的反应 RT RCR 逆转录反应体系体积 20 l缓冲液底物 4种dNTP引物 digo dT 12 18模板 RNA逆转录酶其他试剂 RNA酶抑制剂 MgCl2 DTT 牛血清白蛋白 PCR反应体系同以DNA模板的反应体系 1 将无菌Eppendorf管置冰上 混合 mRNA 1 g l 10 0 lOligo dT 12 18 1 g ml 10 0 l1mol Tris cl PH7 6 2 5 l1mol kcl3 5 l250mmol LMgcl22 0 l4种dNTP 每种浓度均为5mmol L10 0 l0 1mol LDTT2 0 lRNA酶抑制剂25 0单位加水至48 l可用10 50pmol用于PCR扩增上游寡核苷酸引物 被3 引物或向前合成引物 代替Oligo dT 作引物 上游引物与初始mRNA互补 下游引物与 5 引物或向后合成引物 与cDNA第一链互补 1 逆转录 以mRNA为模板合成cDNA 2 加入逆转录酶 MMLV Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶 轻轻振荡 免泡沫产生 因MLV逆转录酶含TritoX 100 必要时可离心片刻去泡沫 3 37 温育1h 逆转录 4 95 5分钟 灭活逆转录酶 5 在无菌0 5mlEp管中混合下液 无菌水30 l10 Buffer10 l4种dNTP 每种浓度为1 25mmol L16 l上游引物 5pmol l 5 l下游引物 5pmol l 5 l逆转录反应混合液5 l加水至终体积100 l 2 按以DNA为模板方法PCR 附普通PCR与RT PCR区别1 反应步骤一个阶段 DNAPCR 分两个阶段 逆转录 cDNAPCR 2 反应体系 1 模板DNAmRNA cDNA 2 引物上 下游引物上 下游引物 3 酶TaqDNA聚合酶逆转录酶 Taq酶 4 底物4种dNTP4种dNTP 5 缓冲体系离子浓度和溶液PH有区别酶保护剂BSADTT关于引物摩尔数计算PCR反应中 引物以pmol数表示 合成引物后 引物量以OD值表示 换算如下 OD为1的引物为33 g引物的分子量 碱基数 330引物pmol数 OD值 33 100000 碱基数 330 OD值 10000 碱基数 33 三 PCR产生的积累规律 PCR是酶促核酸体外扩增 扩增过程遵循酶催化动力学原理 反应初期 DNA量指数增加 随着场物积累 引物 模板 酶达到一定比例时 酶催化反应趋于饱和 DNA增加减慢进入相对稳定状态 出现 停滞效应 这种效应称 平台期效应 平台效应可能与下述因素有关 1 dNTP 引物浓度降低 2 随产物增加 酶与模板比例下降 3 变性温度 93 95 和温度循环使酶活力和dNTP稳定性下降 4 非特异产物或引物二聚体与反应物竞争 5 产物在高浓度变性不完全 影响引物的延伸 6 产物高于10 8mol L时 可影响Taq酶延伸和加工能力 7 酶与PCR产物结合 酶分子减少 Taq酶特异性 忠实性较好 一般用Taq酶 若进入平台期 一般难避免 产物仍不够用 一般够用 可稀释产物DNA样品103 104倍后 进行新的PCR PCR产物的积累规律 1 模板核酸2 引物0 1 0 5 mol L3 10 50mmol LTris C4 1 5mmol L5 20 200 mol L6 TaqDNA聚合酶7 温度循环参数 五 PCR反应条件的控制 PCR条件的优化 102 105拷贝的靶序列 PCR必需具备的基本条件是 1 模板 DNA或RNA 102 105拷贝的靶序列 2 人工合成寡核苷酸引物 3 缓冲体系 4 Mg2 5 dNTP 6 Taq酶 7 温度循环参数 变性 复性 延伸温度及循环数 8 其他因素如加BSA DTT 矿物油等等 下面我们分别讨论这些反应条件对PCR影响 一 模板核酸 前面三 我们已提到模板据PCR扩增对象及各学科专业知识而定 模板可以DNA需先逆转录cDNA才能进行正常PCR循环 1 不同来源模板DNA或RNA制备请参考实验技术书 2 模板核酸纯化的要求 尽可能纯化 不含DNA酶聚合抑制剂 参考实验技术书籍 3 模板核酸在PCR反应中加入的量 一般为102 105拷贝的靶序列 下述参数供您参考 1 g人基因组DNA相当于3 105个单拷贝靶分子10ng酵母DNA相当于3 105个单拷贝靶分子1ng大肠杆菌DNA相当于3 105个单拷贝靶分子1 M13噬菌体人基因组DNA相当于106个单拷贝靶分子扩增不同拷贝数的靶序列时 加入含靶序列的DNA量亦不同 如 真核rRNA基因有200 500拷贝 反应中仅需加入0 5 2ng人基因组DNA即可 以质粒DNA与以染色体DNA为模板扩增最适条件是不同的 前者所需量少 循环少 温度不如染色体DNA要求严格 扩增染色体DNA至少需要25 30个循环 如在第15循环后补加一些Taq酶获得更好的扩增效果 扩增靶序的长度根据不用目的而不同 用于检测目的扩增片段长度一般为500bp以内 以100 300bp为最好 用Taq聚合酶在合适条件 较长延伸时间 下 可扩增长达10 20kb的片段 二 引物 PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的 因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义 1 引物合成的质量合成引物须PAGE和HPLC纯化 因为合成引物中含有相当数量 错误序列 其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测的碱基修饰的完整链和高分子量产物 这些序列可导致非特异性扩增和信号强度的降低 因此 PCR所用引物质量要高 且需纯化 冻干引物 20 至少保存12 24个月 液体状态 20 可保存6个月 引物不用时应 20 保存 2 引物的设计原则参前述二 逆循基本原则 借助微机帮助有助于PCR成功 3 引物的用量及其计算一般PCR反应物终浓度为0 2 1 mol L 讲义P217为0 1 0 5 mol L 在此范围内 PCR产物量基本相同 但引物低于0 2 mol L时 则产物量偏低 过高会促进引物引导非特异产物合成 还会增加引物二聚体形成 二者与靶序列竞争DNA聚合酶 dNTP底物 从而使靶序列的扩增量降低 引物浓度可按下述公式计算 摩尔淬灭系数 Em 是1cm光程比色杯中测定1mol L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度 OD 值 Em a 16000 b 12000 c 7000 d 9600 abcd代表寡核苷酸中A G T C的个数 例 一纯化的20mer寡核苷酸溶于0 1ml水中 取10 l稀释至1 0ml 测其OD为0 76 原液OD为76 若AGTC均为5 代入公式Em为223000 76 223000 340nmol L 三 耐热DNA聚合酶 自从耐热Taq酶引入PCR后 又有许多耐热DNA聚合酶 VENT和Tth等 用于PCR 以Taq酶 PE cetus公司 多用 该酶75 80 时具有最高生物活性 温度过低 过高 酶活性下降 后者还与引物 模板稳定性有关 在92 5 95 97 其活性半衰期分别为130min 40min 5min具有良好的热稳定性 100 l反应体系中加入0 5 5单位Taq酶 过高 琼脂糖凝胶电泳会出现非特异扩增带 过低 靶序列产量低 PCR后可通过1 99 100 加热10min 或2 加入EDTANAa2至10mmol L螯合Mg2 或3 酚 氯仿抽提 乙醇沉淀PCR产物灭活Taq酶 Taq酶有5 3 而无3 5 外切酶活性 因此它不具有大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow酶的3 5 校对活性 它的忠实性较后者差 DDDPI 分子量109KD 此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成两个片段 一个片段为76KD 有聚合酶 3 5 外切酶活性 即Klenow片段 另一为34KD 有5 3 外切酶活性 聚合作用 以DNA为模板 将dNTP逐一按碱基配对原则加在引物3 OH末端 3 5 外切酶活性 能识别清除错配的引物末端 有校正功能 5 3 从5 切除DNA链 产生5 单核苷酸 可能参入切除RNA引物 跳过几个核苷酸切除错配核苷酸 在DNA损伤修复中起作用 缺口平移标记32PDNA探针DNA酶I PCR产物整体用作探针或直接测序 偶然错配则无关紧要 假若需要克隆单个DNA分子 如突变DNA分子 则需要来自至少两个独立扩增系统或进行确证性测序加以印证 四 镁离子浓度 Mg2 是TaqDNA聚合酶活性所必须的 Mg2 浓度除影响酶活性和忠实性外 也影响引物退火 模板与PCR产物的解链温度 产物的特异性 引物二聚体形成等 过低 酶活力降低 过高 酶催化非特异性扩增 酶需要的是游离的Mg2 浓度 PCR模板DNA原液中如含EDTA螯合剂 引物和dNTP的磷酸根均可与Mg2 结合降低Mg2 浓度 最好对每种模板 每种引物组合都要进行Mg2 浓度优化 办法是 实验中模板 引物 dNTP 设定循环参数 Tris cl和Kcl相对固定 Mg2 以0 5mmol L开始以0 5mmol L浓度递增 电泳EB染色确定各扩增产物量 确定Mg2 的最佳浓度 Mg2 浓度一般为0 5 2 5mmol L之间 常用1 5mmol L 对应dNTP浓度为200 mol L左右 五 dNTPs 六 缓冲液 储备dNTP液具有较强的酸性 应以NaOH将PH调至7 0 7 5 分装 20 保存 避免过多冻融会使dNTP降解 其浓度为20 200 mol L 高 增加错误掺入率 加快反应 低 提高实验精确性 使反应速度下降 目前最为常用的缓冲液组成为10 50mmol Ltris Hcl PH8 3室温 72 PH7 2 50mmol LKcl 1 5mmol LMgcl2 Tris是双极性离子缓冲液 20 Pka8 3 在实际PCR变化在6 8 7 8之间 加大Tris浓度 如至50mmol L 改变反应液缓冲能力 PH8 9 有时会增加产量 50mmol L以内Kcl有利于引物退火 大于此浓度则抑制酶活性 加入BSA DTT 明胶或Tween20 有助于酶稳定 七 温度循环参数 1 变性温度和时间一般94 95 30 60s可使各种复杂DNA分子完全变性 变性不完全会导致PCR失败 过高 时常会影响Taq酶活性 简单办法先变性 如97 7 10min 再加酶 过低过短时间 变性不完全 2 复性 退火 温度与时间复性温度决定PCR的特异性 一般为45 55 低 易退火 但特异性低 高 退火较难 但特异性高 引物复性温度和时间取决于引物碱基组成 长度 扩增引物在PCR条件下真实Tm值 5是合适的复性温度 Tm 4 G C 2 A T Tm A260达到最大值1 2 即变性DNA达到DNA总量1 2时的温度 退火时间30s足以使引物和模板结合3 延伸温度与时间引物延伸温度一般为72 不适合温度会影响产物特异性及产物 延伸时核苷酸掺入速度取决于缓冲体系 PH 盐浓度和DNA模板性质 延伸时间取决于靶序列的长度和浓度 72 1min对于长达2kb的扩增片段是足够的 3 4kb需要3 4min 时间过长会导致非特异性扩增带 对很低浓度底物 时间要长些 4 循环数不管模板浓度多少25 30次循环是比较合理次数 因20 25次循环 PCR产物积累可达最大值 每次虽不能不能达到100 但25 30次应该足够了 六 PCR实验中应注意的事项 一 防止污染 由于PCR强大扩增能力与检测敏感性 极微量污染便可导致假阳性结果 采取如下措施 有助于防止污染 1 小量分装试剂 2 使用一次性吸头及试管 3 分开样品制备 PCR PCR产物分析操作区 4 样品制备按无菌操作进行 避免样品间交叉污染 5 使用专用微量可调加样器用于PCR 带一次性手套 二 实验中的对照 每次实验都要设置严格对照 以监测或追踪污染源和判断实验结果等 阳性对照 阳性模板 阴性对照 阴性模板 试剂对照 除模板外所有组分 监测试剂是否 PCR产物 残留污染等 三 扩增反应总是阴性结果 很少或没检测到产物的对策 四 出现非特异性产物对策 1 取10 扩增混合液作模板再次PCR扩增 2 增加Taq酶量 3 增加靶DNA量 4 若模板为粗制品 纯化样品 样品可能存在抑制物 5 增加循环数 6 适当降低退火温度 1 增加退火温度 2 减少Taq酶浓度 3 减少退火及延伸时间 4 减少引物浓度 5 减少循环次数 第二节PCR技术的扩展 自从Mullis80年代发明PCR技术以来 该技术得到了广泛应用和扩展 PCR技术扩展很多 就以下几种 我们予以简单的介绍 一 多重PCR multiplePCR 用多对引物扩增同一模板的几个区域 多重PCR multiplerPCR 是在一次反应中加入多种引物 同时扩增1份DNA样品中不同的序列 每对引物所扩增的序列长短不同 根据不同长短序列存在与否 检测是否有某些基因片的缺失与突变 如杜氏肌营养不良 Duchennemusculardystrophy DMD 是一种致死的X 连锁阴性遗传病 患者5岁前即出现骨骼肌无力 12岁时卧床不起 20岁左右死于呼吸或心脏衰竭 在男婴中达1 3500 其病因是X染色体短臂2区1带抗肌萎缩蛋白基因缺失或突变导致该蛋白缺失或功能异常 该基因全长2000kb 有70多个外显子 基因缺失集中于9个易发热点区 位于4 8 12 17 44 45 48 51等9个外显子内 已有人设计了9对引物 一次加入反应液 电泳观察相应区带 9条 分别为196 268 288 300 331 416 459 506 547bp 是否缺失 几h内可完成 比分子杂交简单 要快 它可检测出80 DMD 外显子 结构基因编码成分 因其产物要送到胞浆中去 故名 内含子 插入结构基因内而不编码顺序 Exon intron 二 筑巢法PCR 巢式PCR和半巢式PCR nestedprimerPCR 1 设计一对外测引物和一对内测引物2 先用外测引物扩增含目的DNA的大片段3 再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段一般外侧引物扩增30个循环 取10 反应产物加入新试管 加内侧引物 反应液再30个循环 此法的特异性很高 因为模板必须与4个寡核苷酸引物结合才能获得阳性结果 三 二次PCR 又称BosterPCR 分二期执行PCR 第一次先扩增DNA模板中少量拷贝 然后再用一对引物做二次PCR 四 中断性PCR 也是一种两期PCR法 第一期PCR产物作第二期反应的模板 第二期包括原来1条引物和互补扩增产物中心内侧另一条引物 这种PCR特异性强 常用于检测重排的基因 五 共享引物PCR sharedprimerPCR 利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列 其中一条引物可与两种DNA序列互补结合 共享引物PCR示意图 共享引物PCR shared primerPCR 是利用3条引物来扩增两种不同的DNA序列 其中一条引物与两种DNA序列都互补 并与另外两条引物分别组成两对PCR引物 这种PCR常用于细菌学鉴定 确定同一种属细菌的不同种类 六 不对称PCR asymmetric 不对称PCR是在扩增循环中 两条引物采用不同的浓度 获得单链DNA进行序列测定 两引物浓度比为50 100 1 七 彩色PCR colorcomplementationasay 用不同荧光染料分别标记PCR引物 采用多重PCR扩增同一DNA的不同区域 显示不同颜色 用于基因诊断 又称互补着色性检测 是标记引物PCR一种 是利用荧光染料标记引物的5 端 不同荧光标记的引物同时参加反应 扩增后的目的基因会分别带有引物5 端的染料 通过电泳或离心沉淀 肉眼就可以根据不同荧光的色泽判断目标基因是否存在及扩增基因的类型 一般彩色PCR仅需二种不同颜色的引物 一种作为基因检测的引物 另一种作为控制实验条件的内对照 即可检测基因缺失 染色体易位或感染某种病毒 检测多种点突变 几种可疑的病毒感染 HLA位点分析等都可用彩色PCR同时检测多个位点 这大大方便了临床应用 八 反向PCR invertedPCR 用限制酶消化基因组DNA 用连接酶将各片段连接成环状 用限制酶切割已知序列 根据已知序列设计3 端引物和5 端引物 扩增未知序列 又称染色体步移 是指将含有核心区的DNA用合适的限制酶消化后 产生合适于PCR扩增大小的片段 将该片段两端连接起来 成为环状分子 PCR引物与核心区引物两侧的顺序同源 但这对引物的方向延伸是环状分子的未知顺序区而不是分隔两个引物的核心区 可以说 常规PCR是扩增两引物之间的DNA片段 反向PCR是利用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 该技术可对未知序列扩增后进行分析 它不必构建克隆 就可以在侧接区域步移成百上千个碱基对 筛选DNA文库 确定插入支部位的遗传成分和其它中等大小的重复序列 是一种省时 省力的PCR方法 九 锚定PCR anchoredPCR 以mRNA为模板经RT合成cDNA 末端转移酶在cDMA3 末端加上poly dG 尾 Poly dC 锚定引物与poly dG 尾互补结合引导合成未知DNA序列 十 原位PCR insituPCR 固定组织细胞内的DNA或RNA 以其为模板进行PCR反应的过程 十一 定量PCR quantifiedPCR 1 以mRNA为模板合成cDNA2 加入参照基因 待测基因 参照引物 待测基因引物3 PCR扩增4 以参照基因的扩增产物为基础 观测待测基因产物的相对量 十二 差异显示PCR differentialdisplayPCR 1 将两种mRNA逆转录为cDNA第一链2 加入锚定引物 随机引物3 PCR扩增 以扩增引物代表相应mRNA4 分析两种基因表达的差异 十三 重组PCR recombinantPCR PCR参与的体外基因突变或基因融合过程 十四 PCR技术的应用 一 遗传性疾病的基因诊断 例地贫的产前诊断 二 检测癌基因PCR与寡核苷酸探针杂交结合检测ras基因点突变PCR扩增包含ras基因12 13和61位密码子的DNA片段寡核苷酸探针与PCR产物杂交放射自显影 检测点突变发生的类型和部位 三 检测病原微生物PCR检测HIV HBV 巨细胞病毒 人乳头状瘤病毒 肠道病毒 肺炎支原体等 四 PCR在法医学上的应用亲子鉴定个体识别 五 PCR技术在分子生物学中的其它应用DNA克隆 重组PCR 引入点突变 缺失或插入 DNA序列测定 双链直接测序 双链克隆后测序 双链PCR产物加热变性为单链 与某一个方向的引物退火 用双脱氧链终止法可测定一定长度的DNA序列基因扩增转录测序 在PCR时 使用1个5 带T7启动子序列的引物 T7RNA聚合酶以扩增产物为模板合成mRNA 然后以mRNA为模板 用逆转录酶进行测序不对称PCR产生单链测序 用两种不同浓度的引物进行PCR反应 当低浓度引物耗尽时 高浓度引物介导合成单链DNA 然后以单链DNA为模板用双脱氧链终止法测序 第三节扩增大片段核酸的PCR 普通PCR反应体系难以一次扩增3 5kb长的核酸片段 如果要扩增大片段核酸 如30 50kb 则需大片段PCR的方法 称为LA PCR longoraccurate PCR 一 影响大片段核酸扩增的因素 一 DNA链3 端错配 普通PCR所用DNA聚合酶 如Taq酶 没有3 5 核酸外切酶活性 无法消除扩增片段3 端与模板错配 这是限制大片段核酸扩增机制之一 聚合酶在错配处停止不能过去 二 模板DNA链的损伤 模板DNA由于反应体系PH降低脱嘌呤和脱嘧啶造成本身损伤 而Taq酶不能通过该损伤部位 并且低PH值还可以使新合成的DNA链中的核苷酸间的连接键断裂 形成缺口而阻止链的延伸 三 其他因素 影响大片段核酸扩增其他因素还包括PCR添加剂 甘油 有助于PCR反应的复制过程 DMSO 有变性DNA的作用 PCR循环参数 扩增模板的完整性等 Taq酶作用时间持久性 反应一定时间后 酶会自动从DNA模板上滑脱 也影响扩增 二 LA PCR条件的优化 一 DNA聚合酶 有十多种不同的耐热DNA聚合酶可用于PCR扩增 使用这些酶时 应考虑聚合酶能力 忠实性和热稳定性等因素 往往以双聚合酶战略消除合成中出现的3 端错配 或采取合成能力更强的TH聚合酶 因为聚合能力强 3 5 外切活性不能不强 最好应用厂商或文献推荐方法 二 缓冲液 常规PCRTris缓冲液对温度的依耐性较强 poncemicol建议使用对温度不敏感的Tricine缓冲液 提高PCR缓冲液体系PH稳定和缓冲能力 从而减少碱基脱嘌呤 三 Mg2 和K LA PCR中Mg2 K 均低于普通PCR以增加酶的校正功能和活力 四 PCR添加剂 添加甘油和DMSO可分别降低变性温度 保护模板DNA少受损伤 甘油还可以增加酶的热稳定性 五 引物 常规PCR引物设计原则及其浓度也适用于LA PCR最佳的引物设计在扩增特异性和效率之间求得平衡 引物特异性非常重要 其次是引物复性温度Tm应 60 使退火 延伸温度更接近 利于扩增特异性和效率 六 模板 降解的 有缺刻的 未纯化的DNA在常规PCR有成功的报道 LA PCR需要高质量 高纯度 完整的模板 模板浓度需要优化 考虑特异性和效率 有人从0 1ng 100ng进行过研究 七 温度循环参数 变性温度时有赖于模板 引物特性及PCR仪而定 但温度尽可能低 时间尽可能短 以使效率增加 退火和延伸温度可采用合二为一的办法 如60 70 退火延伸5 20min 提高特异性 八 其他因素 PCR仪 第四节连接酶链式反应 连接酶链式反应 ligasechainreaction LCR 又称连接扩增反应 LAR 此反应是以DNA连接酶将其一DNA链的5 磷酸与另一相邻DNA链3 羟基连接起来为基础循环反应 LCR可用于检测点突变等 如在遗传性疾病和肿瘤的诊断 细菌和病毒基因分型及致病力鉴定领域应用等 一 LCR反应的原理 LCR需要两对引物A B和A B 其中引物A与A B与B 互补 双链DNA经加热变性后 两对引物分别与模板变性 复性后引物A与A 的3 端分别与引物B与B 的5 端紧邻 若引物与模板完全互补 则在耐热连接酶作用下 可使相邻两引