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第四章核酸分子杂交 第一节核酸分子杂交的原理 一 核酸的紫外吸收 核酸的特征紫外吸收波长为260nm 二 核酸的变性与复性 核酸的变性是指在理化因素作用下 DNA双螺旋结构遭到破坏的过程 核酸在受热情况下的变性称为热变性 变性DNA存在增色效应 热变性过程中变性一半时的温度称为Tm值 核酸的复性是指变性核酸在去掉变性因素后又恢复其双螺旋结构的过程 复性DNA存在减色效应 核酸杂交是指不同来源的变性核酸在去掉变性因素后其互补序列形成双螺旋结构的过程 三 杂交动力学 四 杂交体系的建立 1 离子强度 离子浓度越高 杂交越容易 一般用5 SSC或6 SSC 1 SSC含0 15mol LNaCl和0 015mol L柠檬酸钠 2 DNA的浓度 一般是浓度越高杂交越快 杂交液的量一般为50 100ul 1cm2杂交膜 探针量为0 1 0 5ug 次 探针浓度太高对杂交并没有好处 3 DNA探针的长度 一般为50 300碱基 太长由于扩散慢对杂交不利 太短也不利于杂交 4 温度 大多数杂交反应在68 进行 含有50 甲酰胺的体系在42 进行 第二节核酸分子杂交的基本方法 Southern印迹杂交的检测对象是DNANorthern印迹杂交的检测对象是RNAWestern杂交的检测对象是蛋白质斑点杂交和狭缝印迹杂交的方法既可检测DNA 也可检测RNA 一 Southern印迹杂交 具体步骤为 1 制备待测DNA样品2 对DNA样品进行酶切消化3 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4 Southern印迹转移前的凝胶处理 碱变性 漂洗 中和等过程 5 Southern印迹转移 6 杂交及杂交结果的显示 二 Nouthern印迹杂交 与Southern印迹杂交方法基本相同 其不同处在于1 RNA在制备时必需利用DEPC抑制RNA酶的活性 以防止RNA被水解2 电泳时需要用甲醛变性凝胶电泳 三 斑点杂交及狭缝杂交 四 原位分子杂交 原位分子杂交是指用探针与组织或细胞中待测核酸分子进行杂交 从而对组织细胞中核酸进行定位 定性和相对定量分析的杂交方法 1 标本制作是关键 要求防止核酸丢失 保持形态结构完整 保证核酸探针能够透到靶区 2 载玻片必需预处理 防止脱片 第三节核酸探针的标记 一 核酸探针的种类 1 基因组DNA探针2 cDNA探针3 RNA探针4 寡核苷酸探针 二 核酸探针的标记物 一 放射性元素标记物1 32P 显影所需时间少 灵敏度高 缺点是半衰期短 射线散射严重2 35S 散射较弱 分辨率高 半衰期长3 3H 分辨率最高 半衰期长但显影时间长 三 核酸探针的标记方法 非放射性探针标记也可以用切口平移法和随机引物法标记 四 核酸探针的纯化 可用葡聚糖层析法 乙醇沉淀法等方法纯化探针 第四节杂交信号的显示 一 放射性同位素探针的显示 保鲜膜包上后放入暗室在低温下对X 胶片曝光一段时间后 通过显影和定影即可 二 非放射性探针的显示 1 偶联反应2
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