美国联邦法规与_中国兽药典_细菌类活疫苗纯粹检验方法的比较分析.pdf

美国联邦法规与 中国兽药典 细菌类活疫苗 纯粹检验方法的比较分析 张 媛 1 蒋玉文1 魏财文1 刘惠文1 李海亮2 杜昕波1 1 中国兽医药品监察所 北京 100081 2 乾元浩生物股份有限公司北京科技分公司 北京 100081 收稿日期 2008 09 09 文献标识码 A 文章编号 1002 1280 2009 01 0025 03 中图分类号 S859 2 摘 要 对美国联邦法规 CFR9 及 中国兽药典 二 五年版三部 中细菌类活疫苗纯粹 检验方法的异同进行了比较分析 并对我国细菌类活疫苗纯粹检验方法提出了修改建议 关键词 美国联邦法规 中国兽药典 纯粹检验 作者简介 张 媛 1980年 女 主要从事兽用生物制品检测 E mai l zhangyuan vidc gov cn A Comparative Analysis of Pure TestM ethod ofVeterinary Bacteria Live Vaccine in CFR 9 and Chinese Veterinary Phar macopoeia ZHANG Yuan 1 JIANG Yu wen 1 WEI Cai wen1 LI U H ui wen1 LIH ai liang 2 DU Xin bo1 1 China Institute of Veterinary Drug Control Beijing 100081 2 Qianyuanhao Biological Co Ltd Beijing 100081 China Abstract Compare the advantages and disadvantages of pure testmethod of veterinary bacteria live vaccine between CFR 9 and Chinese Veterinary Phar macopoeia Based on the results suggestions were made to revise the current Chinese method of pure testmethod of veterinary bacteria live vaccine inChinese Veterinary Pharmacopoeia Key words CFR 9 Chinese veterinary pharmacopoeia pure test method 细菌类活疫苗的纯净性是此类产品的重要质 量指标之一 美国联邦法规 CFR9 和 中国兽药 典 二 五年版三部 均要求对细菌类活疫苗 进行纯粹检验 但二者在检验方法和结果判定上存 在一些差异 现将美国联邦法规与 中国兽药典 细菌类活疫苗中规定的纯粹检验方法进行比较分 析 以期对我国该类产品纯粹检验方法的改进有所 启示 1 美国联邦法规对细菌类活疫苗进行纯粹检验的 规定 1 1 检验用培养基 大豆 酪蛋白消化物培养基 和硫乙醇酸盐培养基 1 2 抽样 每批疫苗随机抽样 10瓶 1 3 检验方法及结果判定 冷冻的液体疫苗需 要先进行解冻 冻干的疫苗需要先恢复原量 疫苗 要用其适宜的培养基或灭菌纯水稀释到 1 000头份 羽份 30mL的浓度 如果生产工艺决定疫苗中 一定会含有影响检验结果的成分 要根据具体情况 对疫苗进行扩大稀释或向其中加入抑制剂或中和 剂来消除影响因素 向 40 mL硫乙醇酸盐培养基中加入 0 2 mL疫 苗稀释液 置 30 35 培养 14 d 以检查是否有杂 菌生长 向 40 mL大豆 酪蛋白消化物培养基中 加入 0 2 mL疫苗稀释液 置 20 25 培养 14 d 以检查是否有真菌生长 认真观察每个培养管中是否有杂菌或真菌生 长 如果视觉观察无法判定时可对疫苗进行进一步 移植培养或进行显微镜检查 如有杂菌生长按下列方法处理 如果 10瓶疫 苗中有 2 3瓶有杂菌生长 而其余均纯粹生长 可 25 2009 43 1 25 27 张 媛 等 中国兽药杂志 加倍抽检数量 即抽取该批疫苗 20瓶样品进行重 检 以排除操作过程中造成的污染 如果 10瓶疫 苗中有 9瓶纯粹 或 20瓶中有 19瓶纯粹 可判定 该批疫苗纯粹检验结果符合规定 如果 10瓶疫苗 中有 4瓶的疫苗有杂菌生长 或在重检过程中 20 瓶疫苗中有 2瓶有杂菌生长 则判定该批疫苗不符 合规定 2 中国兽药典 对细菌类活疫苗进行纯粹检验的 规定 2 1 检验用培养基 硫乙醇酸盐培养基 T G 酪胨琼脂 G A 或适于该菌生长的其他培养基和 葡萄糖蛋白胨汤 G P 2 2 抽样 按每批或每个亚批疫苗瓶数的 1 抽 样 但不应少于 5瓶 最多不超过 10瓶 每瓶分别 进行检验 2 3 检验方法及结果判定 冻干制品需恢复原量 后再进行检验 将供试品直接接种 T G小管 G A斜面或适 于该菌生长的其他培养基各 2支 每支 0 2 mL 1 支置 37 1支置 25 另用 1支 G P小管 接种 0 2mL 置 25 均培养 5日 细菌活疫苗应纯 粹 其他制品应无菌生长 如果培养后混浊不易判定 可移植 1次 再进 行判定 每批抽检的样品必须全部纯粹生长 如果发 现个别瓶有杂菌或结果可疑 可重检原瓶 如果为 安瓿或冻干制品 可重抽样品 如果无杂菌生长 可判为合格 如果仍有杂菌生长 可抽取加倍数量 的样品重检 检验结果如仍有杂菌生长 则作为污 染杂菌处理 3 二者的比较分析 3 1 检验用培养基的比较 美国联邦法规规定使 用大豆 酪蛋白消化物培养基和硫乙醇酸盐培养 基两种培养基 其中大豆 酪蛋白消化物培养基 用于检测真菌和需氧菌 而硫乙醇酸盐培养基用于 检测厌氧菌和需氧菌 中国兽药典规定使用 T G G A和 G P 三种培养基 其中 G P用于检测真 菌 G A用于检测需氧菌 T G用于检测需氧菌和 厌氧菌 3 1 1 G P和大豆 酪蛋白消化物培养基的比较 G P培养基在配方中大量添加了葡萄糖 使培养 基的糖份含量增加 G P培养基的酸碱度为弱酸 性 而大豆 酪蛋白消化物培养基为中性 培养基 内的糖份含量和弱酸性的生长环境均有助于真菌 的快速生长 因此 在对于真菌的检测上 G P要 优于大豆 酪蛋白消化物培养基 1 表 1 G P和大豆 酪蛋白消化物 培养基配方比较 单位 g 蒸馏水 1 000mL 培养基名称G P 2 大豆 酪蛋白 消化物培养基 3 酵母浸出粉 酵母透析液 100 mL 2 5 蛋白胨5 胰酪胨 17 木瓜酶消化大豆粉 3 葡萄糖202 5 磷酸氢二钾12 5 硫酸镁 含 7个结晶水 0 5 氯化钠 5 琼脂粉0 4 pH值6 0 6 67 1 7 5 注 表示培养基配方中没有添加此成分 3 1 2 美国联邦法规和 中国兽药典 所使用硫乙 醇酸盐培养基的比较 硫乙醇酸盐培养基具有氧 化还原电势 可供需氧菌 厌氧菌生长 4 不仅可用 于纯粹检验 而且其中的硫乙醇酸盐有钝化含砷和 汞类物质及防腐剂的作用 可用作含砷 汞或其它 防腐剂疫苗无菌检验的增菌培养基 5 美国联邦 法规和 中国兽药典 所使用硫乙醇酸盐培养基在 配方上只有细微的差别 表 2 美国联邦法规和 中国兽药典 所使用 硫乙醇酸盐培养基配方比较 培养基名称 每 1000 mL蒸馏水中各成分含量 g 中国兽药典 2 美国联邦法规 3 胰酪蛋白胨1520 酵母浸出粉55 葡萄糖55 5 硫乙醇酸钠0 50 5 L 半胱氨酸盐酸盐0 5 L 胱氨酸 0 5 琼脂 粉 0 5 0 70 75 氯化钠2 52 5 0 2 美蓝溶液0 5mL 或 1 刃天青溶液1 0mL0 001 PH7 0 7 26 8 7 2 注 表示培养基配方中没有添加此成分 另外由于 T G既适用于厌氧菌生长 又适用于 需氧菌生长 T G污染后难以判断是厌氧菌造成的 污染还是需氧菌造成的污染 因此 中国兽药典 除 26 中国兽药杂志 2009 43 1 25 27 张 媛 等 使用 G P T G进行细菌类活疫苗的纯粹检验外 还使用 G A或适于该菌生长的其他培养基进行需 氧菌检查 因此 中国兽药典 采用的检验用培养 基比美国联邦法规的相应规定要更科学 3 2 抽检数量的比较 在抽取样品上美国联邦法 规规定每批疫苗抽取 10瓶进行检验 而 中国兽药 典 规定每批疫苗抽取 5 10瓶进行检验 根据统 计学原理 随机抽样数量越多 其结果的可信度越 高 越能客观反映结果 因此 美国联邦规定的抽 检数量对结果判定的客观性在一定程度上比 中国 兽药典 高 3 3 检验方法的比较 3 3 1 在检验的操作上美国联邦法规规定各种疫 苗都要先稀释到一个固定的浓度 即 1 000头份 羽份 30 mL 然后再接种到培养基中 而 中国 兽药典 只规定将冻干苗恢复原量后即可 由于产 品的种类和规格不同 恢复原量后的菌液浓度也存 在一定差异 美国联邦法规的规定比 中国兽药典 更科学 3 3 2 在培养条件和时间上美国联邦法规规定适 宜厌氧菌生长的培养基在 30 35 培养 14 d 适 宜真菌生长的培养基在 20 25 培养 14 d 中 国兽药典 规定适宜需氧菌和厌氧菌生长的培养基 在 37 和 25 分别培养 5 d 适宜真菌生长的培 养基在 25 培养 5 d 研究表明 多数病原菌最适 温度为 35 37 真菌生长最适宜的温度为 20 30 因此 两部法规规定的培养温度都是合理 的 同时绝大多数细菌适宜温度下培养 24 48 h 即可肉眼观察结果 况且随着培养时间的延长 由 于营养物质供应不足或生存空间受限 或代谢产物 积累造成对生长的抑制等原因 细菌的生长速率逐 渐减小 6 因此 中国兽药典 规定的 5 d培养时 间已满足判定要求 比美国联邦法规更合理 3 4 结果判定的比较 在检验结果的判定上 中 国兽药典 要更为严格一些 要求每批抽检的样品 必须全部无菌或纯粹生长 而美国联邦法规允许有 一个样品表现污染 4 我国细菌类活疫苗纯粹检验方法修改建议 4 1 改良培养基配方 刃天青是一种极具实用价 值的指示剂染料 应用范围广泛 7 在培养基中加 入刃天青作为指示剂以判断此培养基的氧化程度 并决定是否需要煮沸驱氧 但刃天青作为一种染 料 在某种程度上可能存在一定的抑菌作用 当细 菌量少 生长很弱时 或者说此培养基营养度不很 高 灵敏度接近边缘时 很可能细菌被抑制 不能生 长造成误判 而且代淑艳等 8 研究发现不同刃天 青含量及加与未加刃天青的 T G培养基的灵敏度 无明显差异 因此建议可适当降低 T G培养基中 刃天青的用量 4 2 增加检验样品量 每批或每亚批疫苗均统一 抽取 10瓶进行检验 4 3 改进检验方法 参照美国联邦法规 统一疫 苗稀释浓度 中国兽药典 中收录的细菌类活疫 苗中除 号炭疽芽孢疫苗和无荚膜炭疽芽孢疫苗 为氢氧化铝胶苗外 其余均为冻干苗 在进行纯粹 检验时 可将冻干苗恢复原量 按照装量统一稀释 为每毫升含有 5头份 羽份 的浓度后再接种培养 基 氢氧化铝胶苗可直接稀释为每毫升含有 5头 份 羽份 的浓度后再接种培养基 参考文献 1 许华玉 刘 鹏 苏德模 无菌检查用真菌培养基与大豆 酪 蛋白消化物培养基的比较试验 J 中国药品标准 2005 6 1 47 49 2 中国兽药典委员会 中华人民共和国兽药典 S 2005年版三 部 附录 37 40 3 美国药典 U nited States Phar macopeia USP 25版 S 2002 1878 4 李影林 中华医学检验全书 M 北京 人民卫生出版社 1996 1069 5 杜 芸 硫