生物化学2 第8章核酸生物合成讲义.doc

第8章 核酸的生物合成 讲义第一节 DNA的生物合成（复制）基本要求：1.掌握与DNA复制、DNA损伤与修复、逆转录过程有关的基本概念。包括：半保留复制，半不连续复制，复制叉，复制子，岡崎片段，领头链，随从链、（端粒，端粒酶）等。2.掌握复制的过程，以及复制过程中涉及到的各种酶、蛋白因子；并掌握原核生物与真核生物复制的相同点与不同点。3.掌握逆转录过程，熟悉逆转录酶的应用。4.了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。 重点：DNA分子在生物体内的合成有三种方式：（1）DNA指导的DNA合成，也称复制，是细胞内DNA最主要的合成方式。遗传信息储存在DNA分子中，细胞增殖时，DNA通过复制使遗传信息从亲代传递到子代。（2）修复合成，即DNA受到损伤（突变）后进行修复，需要进行局部的DNA的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传。（3）RNA指导的DNA合成，即反转录合成，是RNA病毒的复制形式，以RNA为模板，由逆转录酶催化合成DNA。真核生物的DNA合成过程与原核生物基本相似，但机理尚不十分清楚，以原核生物为例介绍其复制过程。难点：DNA的双螺旋结构是复制的结构基础。DNA复制的实质为酶催化的脱氧核糖核苷酸的聚合反应。复制开始时，亲代双链DNA分子解开，分别作为模板，在DNA依赖的DNA聚合酶催化下，按照碱基配对的原则，将四种脱氧核苷酸连接成DNA大分子，合成产物的碱基序列与模板DNA的碱基序列是互补的，子代DNA双链分子中，一条来自亲代的模板链，另一条为新合成的链，故称半保留复制，是生物体最主要的DNA合成方式；合成过程中，自53连续合成一条领头链，不连续地合成一些片断，而后连成一条随从链，所以DNA合成是半不连续合成。反应过程复杂，首先螺旋松弛，双链打开，形成复制叉，然后复制的引发，包括合成引物，形成引发体，最后是DNA链的延长与终止。每一阶段需要有许多酶和蛋白因子参与，包括拓扑异构酶，用于理顺解链过程中造成的链的盘绕、打结等现象；解螺旋酶在蛋白因子的辅助下结合于复制起始点，并打开双链，由单链结合蛋白稳定解开的两股单链；引物酶及其它辅助蛋白因子在打开的双链上催化合成引物，由引物提供3-OH，与原料dNTP的5-P形成磷酸二酯键，然后DNA聚合酶催化这一聚合反应的进行，而DNA连接酶将复制中的不连续片段连接成完整的链。真核生物的复制与原核生物相比，为多个起始点、5种DNA聚合酶以及有端粒复制等特点。一、DNA的复制基本要求：1.掌握复制叉、半不连续复制、岡崎片段、领头链、随从链等基本概念。2.掌握拓扑异构酶、解螺旋酶、单链结合蛋白、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的特点及生物学作用。3.熟悉DNA的合成过程。4.了解半保留复制的实验依据。基本概念：1.中心法则：遗传信息从DNA通过转录流向RNA，RNA通过翻译指导合成蛋白质，这种遗传信息的传递规律称之。少数RNA也是遗传信息的贮存者，RNA能逆转录为DNA，是对中心法则的补充。2.复制（replication）：即DNA的生物合成，以DNA为模板指导合成相同的DNA分子，使遗传信息从亲代传递到子代的过程。RNA病毒的遗传信息储存于RNA分子中，可进行RNA复制并反转录合成DNA。3.半保留复制（semiconservativereplication）：DNA复制时，亲代DNA双螺旋结构解开，分别以解开的两股单链为模板，以dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)为原料，按照碱基互补的原则，合成与模板链互补的新链，从而形成两个子代DNA双链，其结构与亲代DNA双链完全一致。因子代DNA双链中的一股单链源自亲代，另一股单链为合成的新链，形成的双链与亲代双链的碱基序列完全一致，故称为半保留复制。4.复制叉（replicationfork）：原核生物DNA的复制从单一起点开始，双螺旋结构被打开，分开的两股单链分别作为新DNA合成的模板，DNA合成从起点开始向两个方向进行，与单一起点相连的局部结构形状呈“Y”型，称复制叉结构。5.半不连续复制：复制过程中，催化DNA合成的DNA聚合酶只能催化核苷酸从53方向合成，以35链为模板时，新生的DNA以53方向连续合成；而以53为模板只能合成若干反向互补的岡崎片段，这些片段再相连成完整的新链，故称半不连续复制。6.岡崎片段（Okazakifragments）：DNA双链是反向平行的，复制时，亲代双链DNA在复制叉处打开，由于新链的合成具有方向性，即从53，以53DNA链为模板合成反向互补的新链时，只能合成小片段DNA，这些片段根据发现者命名为岡崎片断。7.领头链、随从链：DNA双链是反向的，复制时，两股链均作为模板，但新链的合成只能是53。因此，顺着解链方向合成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链，另一股新链的复制方向与解链方向相反，复制是不连续进行的，这条不连续合成的链称为随从链。8.引发体：是由DnaA蛋白、DnaB蛋白（解螺旋酶）、DnaC蛋白、引物酶和DNA的起始复制区域共同形成的一个复合结构。DnaA蛋白辨认复制起始点，DnaB蛋白有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白组装到复制起始点，引物酶合成引物。（一）、原核生物DNA的复制1与复制有关的酶及蛋白质：（1）拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。其种类有：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II，拓扑异构酶I能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能，并使DNA分子进入负超螺旋。（2）解螺旋酶：DNA进行复制时，需亲代DNA的双链分别作模板来指导子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。（3）单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态，SSB可以模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。（4）引物酶：是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应，若没有引物就不能起始DNA合成。引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA，并由这一小段RNA引物提供3-OH，经DNA聚合酶催化链的延伸。（5）DNA聚合酶：是依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNApol，以DNA为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3-OH末端，合成互补的DNA新链，即53聚合活性。原核生物的DNA聚合酶有DNApolI、DNApolII和DNApolIII，DNApolIII是复制延长中真正起催化作用的，除具有53聚合活性，还有35核酸外切酶活性和碱基选择功能，能够识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用；DNApolI具有53聚合活性、35和53核酸外切酶活性，53核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段，起切除、修复作用。另外，klenow片断是DNApolI体外经蛋白酶水解后产生的大片段，具有DNA聚合酶和35外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。DNApolII在无DNApolI和DNApolIII时起作用，也具有53和35核酸外切酶活性。（6）DNA连接酶：DNA连接酶用于连接双链中的单链缺口，使相邻两个DNA片段的3-OH末端和5-P末端形成3,5磷酸二酯键。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组、剪接中用于缝合缺口，是基因工程的重要工具酶。2DNA的合成过程：可将复制过程分为起始、延长和终止三个阶段。复制起始：（1）辨认起始点，合成引发体：在E.coli，复制起始点称为oriC，具有特定结构能够被DnaA蛋白辨认结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。（2）形成单链：DNA进行复制时，首先在拓扑异构酶作用下，使分子的超螺旋构象变化，然后在解链酶的作用下，解开双链，才能开始进行DNA的合成。解螺旋酶在蛋白因子的辅助下打开DNA双链，单链结合蛋白SSB结合于处于单链状态模板链上；拓扑异构酶使DNA分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。（3）合成引物：引发体中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3-OH基，使复制开始进行。领头连和随从链均由引物酶合成引物，随从链在复制中需多次合成引物。复制延长：（1）复制方向：原核生物如E.coli，只有一个起始点oriC，两个复制叉同时向两个方向进行复制，称为双向复制。（2）链的延长：按照与模板链碱基配对的原则，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使链延长。由于DNA双链走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸从53方向合成，领头链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一股模板链沿53方向解开，随从链的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岡崎片段。DNA聚合酶I的即时校读，DNA聚合酶III的碱基选择功能，使复制具有保真性。复制终止：原核生物如E.coli，他的两个复制叉的汇合点就是复制的终点。由RNA酶切去领头链和随从链中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四种脱氧核糖三磷酸为原料自53方向延长填补。最后，DNA连接酶由ATP供能，将两个不连续片段相邻的5-P和3-OH连接起来，成为连续的子链，复制完成。（二）、真核生物的复制*：真核细胞的一生可以定义为一个细胞周期，细胞增殖时，DNA通过复制使其含量成倍增加，随后细胞分裂，成为两个子代细胞，DNA将亲代的特征传递到子代。细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，DNA的复制只发生在S期。与原核生物相比，真核生物的复制具有以下特点：1.多复制子：真核生物的DNA复制也是半保留复制。染色体线性分子的复制有多个起始点，每个起始点由两个反向运动的复制叉组成，进行双向复制。由一个起始点控制的DNA复制称为一个复制子。2.5种DNA聚合酶：与原核生物不同，真核细胞含有5种DNA聚合酶：、和。除了外，所有DNA聚合酶存在于核内。DNA聚合酶和在复制延长中起催化作用，DNA聚合酶延长随从链，DNA聚合酶延长领头链。DNA聚合酶和在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。DNA聚合酶在线粒体中，用于线粒体DNA的复制。3.端粒复制：真核生物染色体线性分子的复制，领头链可连续完整复制，而随从链3端引物除去后的空隙无法填补，会造成缩短了的子代的双链，解决的途径是用端粒酶来复制染色体的末端（端粒）。端粒是染色体末端具有特定重复序列和蛋白质的结构，端粒酶是一种逆转录酶，由酶和含重复序列的RNA分子组成，它以自身的RNA分子为模板从随从链的3端合成端粒的重复序列，使随从链延长，以防止随从链在每次复制时被缩短。二、DNA的修复合成*受环境理化因素或生物学因素的影响，DNA序列会发生改变，包括碱基的变化、链的断裂、交联等，通过一定的修复机制对损伤DNA进行校正，保证遗传信息的稳定。基本要求：1掌握DNA突变的概念及突变类型。2掌握损伤DNA的修复机制。3了解突变的意义及引起突变的因素。4了解引起地中海贫血和镰形红细胞贫血的分子机制。基本概念：1突变：是指DNA分子中碱基序列的改变，从而影响其表达产物的结构与功能。2框移突变：基因编码区域插入或缺失碱基，DNA分子三联体密码的阅读方式改变，使转录翻译出的氨基酸排列顺序发生改变，称为框移突变。3个或3n个碱基插入或缺失，不一定引起框移突变。3切除修复：是最重要的修复方式，由UvrA、UvrB、UvrC、DNA-polI、dNTP、连接酶参与。首先UvrA、UvrB辨认损伤部位并与之结合，UvrC切除损伤的DNA，DNA-polI以dNTP为原料，填补切除空隙，最后由连接酶连接缺口，完成修复。（一）突变类型：1点突变：又称错配。DNA分子中一个碱基的变异，包括转换和颠换。2缺失：DNA分子中一个核苷酸或一段核苷酸的消失。3插入：一个核苷酸或一段核苷酸插入到DNA分子中。4重排：DNA链内部重组，使其中一段方向反置或大片段的链在DNA分子内迁移。（二）修复方式：1直接修复：又称光修复，由光修复酶修复因紫外照射引起的嘧啶二聚体，使其还原。2切除修复：见上。3重组修复：当损伤的DNA尚未进行修复就已经进行复制，复制出的子代DNA会出现缺口，此时所产生的子代DNA就需进行重组修复。重组蛋白RecA具有核酸酶活性，将健康母链中与缺口对应的一股DNA片段重组到子链缺口处，而健康母链出现的缺口，可按健康的模板由DNA聚合酶催化填补，然后由连接酶连接，最后将健康链完全复原。4SOS修复：是DNA损伤到难以继续复制时，细胞采取的一种应急性修复方式。DNA损伤严重，诱导出一系列的复杂反应，产生SOS修复酶系，包括重组蛋白、调控蛋白以及复制、修复的酶系统等。三、DNA的反转录合成反转录又称逆转录，指遗传信息从RNA流向DNA。是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的DNA单链，催化这一过程的酶称反转录酶，RNA病毒中都含有此酶。1反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。2合成过程；RNA为模板，在反转录酶的催化下，合成与RNA互补的DNA单链，形成杂化双链，反转录酶将其中RNA链水解，在以互补的DNA链为模板，合成双链DNA。3反转录方向：53。第二节 RNA的生物合成重点：转录的反应体系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，包括各种RNA前体的加工过程。难点：转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），第、类和第类内含子的剪接过程，四膜虫rRNA前体的加工，核酶的作用机理。一模板和酶要点：1模板RNA的转录合成需要DNA做模板，DNA双链中只有一股链起模板作用，指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（templatestrand），与之相对的另一股链为编码链（codingstrand），不对称转录有两方面含义:一是DNA链上只有部分的区段作为转录模板(有意义链或模板链),二是模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上。2RNA聚合酶转录需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多个亚基组成:2称为核心酶,转录延长只需核心酶即可。2称为全酶,转录起始前需要亚基辨认起始点,所以全酶是转录起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-pol、三种,分别转录45s-rRNA;mRNA(其前体是hnRNA);以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。3.模板与酶的辨认结合转录模板上有被RNA聚合酶辨认和结合的位点。在转录起始之前被RNA聚合酶结合的DNA部位称为启动子。典型的原核生物启动子序列是-35区的TTGACA序列和-10区的Pribnow盒即TATAAT序列。真核生物的转录上游调控序列统称为顺式作用元件,主要有TATA盒、CG盒、上游活化序列(酵母细胞)、增强子等等。和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控转录的作用,统称为反式作用因子。反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子(TF),相应于RNA-pol、的是TF、TF、TF。TF又有A、B、C、D、E、F多种及其亚类。基本概念：1.不对称转录:两重含义,一是指双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);二是对不同基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链，即模板链并非永远在同一单链上。2.编码链:DNA双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由T代替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名。3（sigma）因子:原核生物RNA聚合酶全酶的成份,功能是辨认转录起始区,这种因子称70,此外还有分子量不同,功能不同的其他因子。基本要求：掌握转录与复制的区别，转录的不对称性，原核生物的RNA聚合酶的组成及各亚基的功能，真核生物RNA聚合酶的分类、性质及功能，原核生物启动子的结构特点，了解真核生物RNA聚合酶的组成，研究转录起始区的方法。二转录过程1转录起始：转录的起始就是生成由RNA聚合酶,模板和转录5端首位核苷酸组成的起始复合物。原核生物RNA5端是嘌呤核苷酸(A、G),而且保留三磷酸核苷的结构,所以其起始复合物是:pppG-DNA-RNA聚合酶。真核生物起始,生成起始前复合物(PIC)。例如RNA-pol-转录,是由各种TF相互辨认结合,再与RNA聚合酶结合,并通过TF结合到TATA盒上.2.转录延长:转录的延长是以首位核苷酸的3-OH为基础逐个加人NTP即形成磷酸二醋键,使RNA逐步从5向3端生长的过程。在原核生物,因为没有细胞膜的分隔,转录未完成即已开始翻译,而且在同一DNA模板上同时进行多个转录过程。电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上的小黑点(多聚核糖体),是转录和翻译高效率的直观表现。3转录终止：转录的终止在原核生物分为依赖Rho因子与非依赖Rho因子两类。Rho因子有ATP酶和解螺旋酶两种活性,因此能结合转录产物的3末端区并使转录停顿及产物RNA脱离DNA模板。非依赖Rho因子的转录终止,其RNA产物3-端往往形成茎环结构,其后又有一串寡聚U。茎环结构可使因子聚合酶变构而不再前移,寡聚U则有利于RNA不再依附DNA模板链而脱出。因此无论哪一种转录终止都有RNA聚合酶停顿和RNA产物脱出这两个必要过程。真核生物转录终止是和加尾(mRNA的聚腺昔酸polyA)修饰同步进行的。RNA上的加尾修饰点结构特征是有AAAUAA序列。基本概念：1转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC):是真核生物转录因子与RNA聚合酶一同结合于转录起始前的DNA区域而成的复合物。2加尾修饰点：真核生物mRNA转录不是在mRNA的位置上终止，而是在数百个核苷酸之后，研究发现在编码链读码框架的3端之后，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多GC的序列，这些序列称为加尾修饰点,转录越过修饰点后，mRNA在修饰点处被切断，随即加入polyA。3Rho因子：是原核生物转录终止因子,有ATP酶和解螺旋酶活性。转录终止也可不依赖Rho因子。基本要求：掌握原核生物的转录起始复合物的形成过程，真核生物转录起始及起始前复合物(PIC)的生成，RNA聚合酶催化的转