glu发酵.ppt

2020 2 9 1 谷氨酸的发酵与提取 谷氨酸简介味精简介谷氨酸生产菌的选育谷氨酸发酵工艺的研究实例 2020 2 9 2 谷氨酸简介 L 谷氨酸是蛋白质的主要构成成分 谷氨酸盐在自然界是普遍存在的 多种食品及人体内都含有谷氨酸盐 谷氨酸最重要的用途是生产味精 味精是谷氨酸一钠盐 MonosodiumGlutamate 作为一种食品风味增强剂 是食品的一种基础调味成分 是人体营养物质之一 成年人可以无疑虑地按个人的喜爱程度摄取 0 12公克 公斤体重 通过发酵工艺生产的味精 可以提高食品的鲜度 增加食欲 谷氨酸是构成蛋白质的氨基酸之一 虽然它不是人体必需氨基酸 但它可以作为碳氮营养参与机体代谢 有较高的营养价值 谷氨酸在被人体吸收后易与血氨形成谷氨酰氨 能解除代谢过程中氨的毒害作用 因而能预防和治疗肝昏迷 保护肝脏 另外谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂 对于治疗脑震荡或神经损伤等具有一定的疗效 2020 2 9 3 味精简介 最近科学研究证实 人类的味觉除了原本发现的酸 甜 苦 咸等四种外 尚有第五种基本味觉存在 那就是 甘旨味 也就是俗称的 鲜味 由氨基酸与有机酸组成的复杂的味道 许多食物都含有鲜味成分 如海带中的谷氨酸钠 贝类中的琥珀酸等 其中以谷氨酸钠 即俗称的味精 最具代表性 2020 2 9 4 味精简介 1908年日本东京大学池田 Ikeda 教授分析海带成分 发现其中含有大量的谷氨酸钠 并从38公斤海带煮汁中提取了30克味精 1909年池田教授与铃木三郎成立味之素公司 1923年中国上海天厨味精厂以水解法生产佛手牌味精 1958年开始以发酵法生产味精 2020 2 9 5 味精简介 味精的化学名称为谷氨酸钠 MonosodiumGlutamate 它是以天然食物 如小麦 玉米 为原料 经发酵提纯后的结晶产品 具有特别的鲜味 1 味精是食物中的天然氨基酸食物中有五大基本营养素 糖类 蛋白质 脂肪 矿物质和维生素 其中 蛋白质由二十种氨基酸结合而成 谷氨酸是其中一种 且所占比例远高于其他种类的氨基酸 可见其对生物体的重要性 2 为什么味精是谷氨酸的钠盐当谷氨酸与其它氨基酸共同结合成蛋白质时 因其隐藏于蛋白质分子中 故无法刺激味蕾而显现出鲜味 一旦其由蛋白质中释放出来而成为游离氨基酸 而且与食盐中的钠离子共同存在时 则会表现出特别的鲜味 这就是为什么现在的味精要做成谷氨酸钠结晶的缘故 2020 2 9 6 味精简介 2020 2 9 7 谷氨酸生产菌的选育 1946年 美国农业部研究所Lockwood等发现在葡萄糖培养基中的好气培养荧光杆菌是有 酮戊二酸的积累 并发表了采用酶法或化学方法转化酮酸为谷氨酸的研究报告 1956年日本人木下与朝井分别报道了用微生物直接发酵糖类生产谷氨酸的研究 并于1957年实现谷氨酸发酵工业化生产 之后发酵法生产谷氨酸即取代水解法成为工业生产谷氨酸的主要方法 今天 世界上几乎所有谷氨酸都由发酵法获得 谷氨酸发酵是氨基酸发酵的开端 是微生物积累含氮初级产物的最早例子 以此为转机 其它氨基酸 核酸发酵迅速发展 形成了新型发酵工业 2020 2 9 8 谷氨酸生产菌的选育 1958年 我国也开始了谷氨酸发酵研究 1960年 周光宇和钱存柔先后连续报道了产谷氨酸细菌 酮戊二酸短杆菌2990 6 Brevibacteriumketoglutamicus29906 的分离筛选 分类鉴定和代谢方面的研究 但是该菌未能应用于生产 1961年上海轻工业研究所发酵室分离筛选到一株谷氨酸产生菌 黄色短杆菌No 617 BrevibacteriumflavumNo 617 并于1964年通过2500L罐的中试鉴定 不久在上海天厨味精厂正式工业化生产 2020 2 9 9 谷氨酸生产菌的选育 1962年 中国科学院微生物研究所成功地分离筛选到两株谷氨酸产生菌 分别命名为北京棒杆菌AS1 299 CorynebacleriumPekineseAS1 299 和钝齿棒杆菌AS1 542 CorynebacleriumcrenatumASl 542 并于1965年采用上述两菌实现了在30M3发酵罐谷氨酸发酵大规模工业化生产 1973年杭州味精厂 天津工业微生物研究所分别成功选育到两株谷氨酸生产菌 分别命名为钝齿棒杆菌B9 CorynebacleriumcrenatumB9 和天津短杆菌T613 CorynebacleriumtientsineseT613 这两株菌种得到了广泛应用 随着优良菌种的发现与改良 我国味精工业得到了飞速的发展 2020 2 9 10 谷氨酸生产菌的选育 1991年 张克旭 陈宁等利用原生质体融合技术 在不对亲株作任何诱变的前提下 成功地使天津短杆菌TG 866和钝齿棒杆菌B9的原生质体进行融合 获得兼有两亲株遗传性状 细胞个体大 产酸高的融合子F263和F288 首先研究了两亲株原生质体的制备 再生及融合的最佳条件 在该条件下 原生质体形成率均超过了99 9 再生率分别为23 和28 原生质体融合率为3 2 10 5 在最佳摇瓶发酵条件下 F263与F288的产酸率分别为8 4 和8 03 转化率均在50 以上 经连续10次摇瓶传代 发现该融合子是稳定的 该菌株己在多家味精厂推广应用并创造了很好的经济效益 2020 2 9 11 谷氨酸生产菌的选育 产生菌株特点 革兰氏阳性不形成芽胞没有鞭毛 不能运动需要生物素作为生长因子在通气条件下才能产生谷氨酸 2020 2 9 12 谷氨酸发酵工艺的研究 谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵 发酵工艺的研究至关重要 发酵的环境条件 如培养基组成 pH 温度 溶氧水平等都明显地影响谷氨酸的产量 2020 2 9 13 谷氨酸发酵工艺的研究 谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径 由三羧酸循环中产生的 酮戊二酸 在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到 2020 2 9 14 2020 2 9 15 菌种扩大培养1 斜面培养 主要产生菌是棒状杆菌属 短杆菌属 节杆菌属 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株 生长特点 适用于糖质原料 需氧 以生物素为生长因子 斜面培养基 蛋白胨 牛肉膏 氯化钠组成的pH7 0 7 2琼脂培养基 32 培养18 24h 谷氨酸发酵工艺的研究 2020 2 9 16 2 一级种子培养 由葡萄糖 玉米浆 尿素 磷酸氢二钾 硫酸镁 硫酸铁及硫酸锰组成 pH7 0 1000ml装180 200ml振荡 32 培养12h 3 二级种子培养 用种子罐培养 接种量为0 2 0 5 用水解糖代替葡萄糖 于32 进行通气搅拌6 8h 种子质量要求 二级种子培养结束时 无杂菌或噬菌体污染 菌体大小均一 呈单个或八字排列 活菌数为108 109 ml 谷氨酸发酵工艺的研究 教材P216 2020 2 9 17 谷氨酸发酵 1 适应期 尿素分解出氨使pH上升 糖不利用 2 4h 措施 接种量和发酵条件控制使适应期缩短 2 对数生长期 糖耗快 尿素大量分解使pH上升 氨被利用pH又迅速下降 溶氧急剧下降后维持在一定水平 菌体浓度迅速增大 菌体形态为排列整齐的八字形 不产酸 12h 措施 及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH 在pH7 5 8 0时流加尿素 维持温度30 32 谷氨酸发酵工艺的研究 教材P216 2020 2 9 18 3 菌体生长停止期 谷氨酸合成 措施 提供必须的氨及pH维持在7 2 7 4 大量通气 控制温度34 36 4 发酵后期 菌体衰老 糖耗慢 残糖低 措施 营养物耗尽酸浓度不增加时 及时放罐 发酵周期一般为30h 谷氨酸发酵工艺的研究 2020 2 9 19 谷氨酸发酵控制 1 生物素 作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶 参与脂肪酸的生物合成 进而影响磷酯的合成 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时 细胞发生变形 谷氨酸能够从胞内渗出 积累于发酵液中 生物素应控制在亚适量 当生物素缺乏时 菌种生长十分缓慢 生物素过量 则发酵过程菌体大量繁殖 不产或少产谷氨酸 代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多 谷氨酸发酵工艺的研究 2020 2 9 20 谷氨酸发酵控制 2 种龄和种量的控制一级种子控制在11 12h 二级控制在7 8h 种量为1 过多 菌体娇嫩 不强壮 提前衰老自溶 后期产酸量不高 3 pH 发酵前期 幼龄细胞对pH较敏感 pH过低 菌体生长旺盛 营养成分消耗大 转入正常发酵慢 长菌不长酸 谷氨酸脱氢酶最适pH为7 0 7 2 转氨酶最适pH7 2 7 4 在发酵中后期 保持pH不变 过高转为谷氨酰胺 过低氨离子不足 谷氨酸发酵工艺的研究 2020 2 9 21 谷氨酸发酵工艺的研究 4 通风 不同种龄 种量 培养基成分 发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同 在长菌体阶段 通风量应较小 如通风量过大 生物素缺乏 抑制菌体生长 在发酵产酸阶段 需要大量通风供氧 以防过量生成乳酸和琥珀酸 但过大通风 则大量积累 酮戊二酸 谷氨酸发酵控制 2020 2 9 22 谷氨酸发酵工艺的研究 防止噬菌体和杂菌的污染从空气过滤 培养基 设备 环境等环节严格把关 谷氨酸发酵控制 2020 2 9 23 谷氨酸的提取 1 等电点法 操作简单 收率60 周期长 占地面积大 谷氨酸发酵工艺的研究 2020 2 9 24 2 离子交换法 用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子 再用热碱洗脱 收集相应流分 再加盐酸结晶 谷氨酸发酵工艺的研究 谷氨酸的提取 2020 2 9 25 2020 2 9 26 谷氨酸发酵工艺的研究 1995年 HuangS 研究了膜过滤应用于谷氨酸回收的方法 以及超滤 反渗透的应用 首先通过北京棒杆菌发酵生产谷氨酸 然后利用超滤来除去杂质 利用反渗透来洗谷氨酸 最后通过等电点法来使谷氨酸沉淀 发现微滤的平均流速比超滤的速度快 反渗透的速度与微滤的速度相当 适合于工业应用 与传统的提取方法 等电点法 离子交换法 相比 产品的纯度与收率分别增加了3 3 和11 1 总收率为89 最初的分析表明 增加的谷氨酸的产量所带来的效益足以补偿膜 电的消耗 另外 由于谷氨酸纯度的增加 使其转变为钠盐 味精 变得更为容易 2020 2 9 27 谷氨酸发酵工艺的研究 2000年 新安江味精厂陈建新等人对流加糖工艺进行了研究 结果在150m3发酵罐上 最高产酸达97g L 转化率达56 51 2001年 西江食品厂黎剑雄等人对谷氨酸生产菌328的分纯保藏方法进行了研究 使用该方法 在200m3发酵罐上可保证菌种平均产酸达108g L 转化率55 5 2020 2 9 28 实例 L 谷氨酸高产菌的选育及其发酵条件的研究 1 出发菌株的选择2 出发菌株生长曲线的绘制3 目的突变株的选育4 谷氨酸高产菌摇瓶发酵条件的研究5 谷氨酸高产菌生产规模发酵条件的研究 2020 2 9 29 1 出发菌株的选择 以黄色短杆菌TJ1为出发菌株 在进行诱变育种实验之前对该菌株进行了形态观察 黄色短杆菌TJ1在显微镜下观察呈短杆状 无芽孢 无鞭毛 不运动 细胞大小为0 7 1 m 1 3 m 革兰氏染色呈阳性 菌体形态比较规则 除分裂时菌体内形成隔壁外 菌体细胞内不具有隔壁 细胞呈单个 成对或八字形排列 在完全培养基平板上于30 培养48h 72h 形成的菌落呈圆形 中央隆起 微黄 表面光滑 湿润 边缘整齐 该菌株能在26 40 pH6 0 9 0范围内生长良好 2020 2 9 30 2 出发菌株生长曲线的绘制 在实际育种工作中 根据经验 一般诱变处理时要求细菌的营养细胞浓度为108个 mL 而且要求细胞处于生理状态同步阶段 这样可以保证诱变时有足够的菌体以增加变异细胞的总数 同时减少分离性表型延迟现象的发生 使得突变率较高而且重现性好 为此 常选用对数生长中后期的细菌细胞进行诱变处理 此时的细胞不但菌浓合适 生理状态同步 而且此时的绝大多数细胞对理化因素敏感 有利于诱变剂的作用 2020 2 9 31 2 出发菌株生长曲线的绘制 黄色短杆菌TJ1在完全培养基中 于30 96次 分振荡培养的生长曲线如图所示 黄色短杆菌TJ1在培养4h后进入对数生长期 在9 10h左右结束对数生长 转入稳定期 故选取菌龄为8 5h的细胞作为诱变用菌株 2020 2 9 32 4 谷氨酸高产菌摇瓶发酵条件的研究 4 1应用正交设计试验优化种子培养基4 2种子培养条件的研究4 3摇瓶发酵培养基组成的单因素试验4 4低糖补料摇瓶分批发酵工艺的研究4 5优化条件下的摇瓶发酵过程曲线 2020 2 9 33 4 1应用正交设计试验优化种子培养基 良好的种子是发酵的基础 而种子的好坏与种子培养基配比有很大关系 种子培养基要能使种子生长快速 旺盛 发酵高产 稳产 同时发酵工业一般要求种子培养时间不宜过长 以缩短发酵周期 将CN1021菌株接入不同配比的种子培养基 培养至对数生长中后期 接入发酵培养基 发酵42小时 以产酸为指标 决定种子培养基的最佳配比 实验所用种子培养基的主要成份包括 葡萄糖 玉米浆 酵母膏 K2HP04 故进行四因素三水平的正交试验 L9 34 由于因子个数和正交表的列数相等而没有误差列 因此必须进行重复实验 每种实验重复三次 2020 2 9 34 4 1应用正交设计试验优化种子培养基 按20 接种量将种子液4mL接入装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中 8层纱布封口 置于往复式摇床上 33 96转 分振荡培养 视pH 残糖情况及时流加尿素及700g L葡萄糖溶液 当pH降至7 0时 补加200g L尿素溶液0 6 0 2mL 瓶 发酵42小时 正交试验因素水平的设计 2020 2 9 35 4 1应用正交设计试验优化种子培养基 2020 2 9 36 4 1应用正交设计试验优化种子培养基 由实验结果可确定这四个因素的最优水平为A2B2C2D2 即 葡萄糖30g L 玉米浆40mL L 酵母膏5 0g L 磷酸氢二钾2 0g L 2020 2 9 37 4 1应用正交设计试验优化种子培养基 由于正交实验所确定的最佳条件并未被包含在正交表的九个实验内 为了进一步确认计算结果 按最佳条件进行验证试验 结果如表4 4所示 可以看出 按照获得的最佳种子培养基配方所做的验证试验的平均谷氨酸产量为108g L 2020 2 9 38 4 2种子培养条件的研究 4 2 1种子培养基pH值的影响4 2 2种子培养基最佳装液量的确定4 2 3种子培养温度的确定4 2 4种子培养时间的确定4 2 5种子接种量的确定 2020 2 9 39 4 2 1种子培养基pH值的影响 在谷氨酸发酵过程中 pH值不断变化 因此要不断补充尿素作为氮源和调节pH值 当流加尿素后 尿素分解使pH升高 氨被利用和产物生成又使pH值下降 这样反复进行直至培养结束 在谷氨酸摇瓶发酵过程中 pH值调节主要采用尿素流加法 由于尿素的分解 利用及pH值变化具有一定的规律性 容易控制流加的量和次数 流加量主要根据pH值的变化 还需考虑到菌体生长 耗糖 培养的不同阶段来决定 一般来讲 pH值过低菌体易衰老 pH值过高易使菌体自溶 2020 2 9 40 4 2 1种子培养基pH值的影响 2020 2 9 41 4 2 2种子培养基最佳装液量的确定 谷氨酸发酵好气性发酵 溶解氧对谷氨酸产生菌种子培养及发酵影响很大 在培养过程中应控制通风 为方便操作 采用固定摇床转速 考查用相同规格三角瓶在不同装液量情况下对种子生长的影响 进行种子培养1Oh 摇瓶发酵42h 不同种子培养基装液量对种子生长的影响如图所示 2020 2 9 42 4 2 2种子培养基最佳装液量的确定 装液量过低 导致溶解氧过高 不利于长菌 装液量过高 导致溶解氧过低 菌体呼吸受到抑制 从而抑制生长 500mL三角瓶的种子培养基装液量为20mL时所培养的种子 相应的谷氨酸产量较高 说明谷氨酸高产菌CN1021在种子培养过程中就必须控制较大的通风 以使其强制发酵得以成功 2020 2 9 43 4 2 3种子培养温度的确定 温度对谷氨酸发酵的影响是多方面的 从酶促反应动力学来看 温度升高 反应速度加快 生长繁殖快 但温度越高 酶失活越快 菌体易于衰老 影响产物生成 温度还影响营养物和氧在种子液中的溶解 菌体生物合成方向以及菌体的调节 2020 2 9 44 4 2 3种子培养温度的确定 2020 2 9 45 4 2 4种子培养时间的确定 种子培养时间过短 接入发酵培养基后往往出现生长缓慢 发酵周期长 产酸低 种子培养时间过长 菌体衰老 活力降低 会引起产酸能力下降和菌体过早自溶 在谷氨酸发酵中 种子培养时间不宜过长 以菌体处于分裂旺盛的对数生长中后期为宜 此时的种子分裂旺盛 质量高 接入发酵培养基后能很快进入对数生长 有利于缩短发酵周期和提高产酸率 2020 2 9 46 4 2 4种子培养时间的确定 CN1021在培养4 5h左右开始进入对数生长期 在10h左右结束对数生长 转入稳定期 且此时种子培养液的pH降至7 0 2020 2 9 47 4 2 5种子接种量的确定 接种量对发酵的影响比较大 若接种量太小 则菌体增长缓慢 培养时间长 使发酵周期延长 同时影响菌种的活力 不利于高产酸 若接种量太大 虽然缩短了长菌的时间 但菌种容易衰老 也不利于高产酸 2020 2 9 48 4 2 5种子接种量的确定 2020 2 9 49 4 3摇瓶发酵培养基组成的单因素试验 发酵培养基与种子培养基不同 它不仅是供给菌体生长繁殖所需的营养和能源 而且也是构成谷氨酸的物质来源 要积累大量的谷氨酸 就必须要有足够量的碳源和氮源 当然 其它无机盐及生长因子也是必不可少的 碳源是构成菌体和合成谷氨酸的碳架及能量的来源 氮源是合成菌体蛋白质 核酸等含氮物质和合成L 谷氨酸氨基的来源 氮源分为无机氮和有机氮 一般菌体利用无机氮比较迅速 利用有机氮较缓慢 无机盐类常用的有K2HPO4 MgSO4 MnS04 FeS04等 生长因子主要是必需氨基酸 核苷酸和维生素等 2020 2 9 50 4 3摇瓶发酵培养基组成的单因素试验 4 3 1不同碳源对L 谷氨酸发酵的影响4 3 2不同葡萄糖浓度对发酵的影响4 3 3生物素 玉米浆用量对发酵的影响4 3 4MgSO4用量对发酵的影响 2020 2 9 51 4 3 1不同碳源对L 谷氨酸发酵的影响 目前所用的谷氨酸产生菌均不能利用淀粉 只能利用葡萄糖 蔗糖 果糖 麦芽糖 2020 2 9 52 4 3 2不同葡萄糖浓度对发酵的影响 培养基中葡萄糖浓度与谷氨酸发酵有密切关系 在一定的范围内 谷氨酸产量随葡萄糖浓度的增加而增加 但是 若葡萄糖浓度过高 由于渗透压过大 则对菌体的生长很不利 谷氨酸对糖的转化率降低 因此 有必要对初糖浓度加以确定 2020 2 9 53 4 3 2不同葡萄糖浓度对发酵的影响 2020 2 9 54 4 3 3生物素 玉米浆用量对发酵的影响 谷氨酸强制发酵的特点就是高生物素 大接种量 高通风量 生物素是黄色短杆菌的生长因子 而且生物素对CO2固定反应也有重要影响 因为生物素是丙酮酸梭化酶的辅酶 直接参与CO2固定反应 据有关资料报道 当生物素大过量 100 g L以上 时 CO2固定反应可提高30 玉米浆中含有丰富的氨基酸 核苷酸 维生素 无机盐等 特别是含有丰富的生物素 2020 2 9 55 4 3 3生物素 玉米浆用量对发酵的影响 当生物素的质量浓度为100 500 g L时 对菌体生长已无积极意义 但随着生物素质量浓度的提高 谷氨酸产量逐渐提高 这是因为过量的生物素可以激活二氧化碳固定反应 增加了谷氨酸前体物的合成 从而造成谷氨酸的大量积累 2020 2 9 56 4 3 4MgSO4用量对发酵的影响 MgSO4对谷氨酸发酵的影响很大 镁是许多重要酶如己糖磷酸化酶 羧化酶的激活剂 能刺激菌体生长 而硫是构成蛋白质和某些酶的活性基 2020 2 9 57 4 4低糖补料摇瓶分批发酵工艺的研究 补料分批发酵是指在发酵过程中 连续或间歇补加一种或几种培养基成分 但不同时取出发酵液的发酵方法 目前 国外谷氨酸发酵均采用低糖流加分批发酵工艺 与分批发酵相比 采用低糖流加分批发酵工艺 可以降低发酵液中底物浓度及发酵液粘度 从而提高菌体对氧和营养成分的利用率 更有利于目的产物的生成 达到大幅度提高产量的目的 2020 2 9 58 4 4低糖补料摇瓶分批发酵工艺的研究 4 4 1最适初糖浓度的选择4 4 2最适残糖维持浓度的确定 2020 2 9 59 4 4 1最适初糖浓度的选择 降低发酵液中的糖浓度 可降低渗透压 有利于菌体的生长和代谢产物的排泄 同时可提高氧的传递速率 提高溶氧水平 另据报道 采用低糖流加工艺 可以激活二氧化碳固定反应 从而提高糖酸转化率 目前 国际上普遍采用低糖流加工艺强制发酵生产谷氨酸 可以说采用低糖流加工艺进行谷氨酸发酵 是我国味精行业今后的发展方向 2020 2 9 60 4 4 1最适初糖浓度的选择 2020 2 9 61 4 4 2最适残糖维持浓度的确定 大量研究报道指出 采用低糖流加工艺进行谷氨酸发酵时 残糖维持浓度对目的产物的积累至关重要 2020 2 9 62 4 5优化条件下的摇瓶发酵过程曲线 定时取样测定发酵液的吸光度 残糖和L 谷氨酸产量 取三瓶测定结果的平均值 绘制菌株CN1021L 谷氨酸发酵过程曲线 结果如图4 21所示 2020 2 9 63 4 5优化条件下的摇瓶发酵过程曲线 2020 2 9 64 5 谷氨酸高产菌生产规模发酵条件的研究 5 1实验方法5 2一级种子培养条件的确定5 3二级种子培养条件的确定5 46m3发酵罐发酵条件的研究 2020 2 9 65 5 1实验方法 菌种活化 取斜面保藏菌种一环 划线接种于活化斜面上 于30 恒温静置培养18 20h 一级种子的培养 取新鲜活化斜面菌种2支 各用1OmL无菌肉汤全部洗下 转接于装有1200mL种子培养基的5000mL三角瓶中 30 80次 分 振荡培养13h 二级种子的培养 取4800mL一级种子培养液 转接于装有400L二级种子培养基的600L二级种子罐中 30 240r min通气培养26h 视pH 残糖情况及时流加液氨及640g L浓缩糖 使pH维持在7 1 7 2 使残糖维持在15g L 2020 2 9 66 5 1实验方法 谷氨酸发酵 取最适种龄的二级种子 按15 接种量接入装有2700L发酵培养基的6000L发酵罐中 33 220r min发酵32h 视pH 残糖情况及时流加液氨 使pH维持在7 2 7 3 当残糖低于15g L时 流加640g L浓缩糖 使残糖维持在15g L 2020 2 9 67 5 2一级种子培养条件的确定 菌种的扩大培养就是为发酵提供相当数量的代谢旺盛的种子 谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子扩大培养流程 即斜面培养 一级种子培养 二级种子培养 发酵 一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体 由于一级种子的质量好坏直接影响发酵的成败 因此必须对其有关条件进行研究 2020 2 9 68 5 2一级种子培养条件的确定 5 2 1一级种子培养液终pH值的影响5 2 2一级种子培养基最佳装液量的确定5 2 3一级种子培养时间的确定 2020 2 9 69 5 2 1一级种子培养液终pH值的影响 在一级种子培养过程中 发酵液的pH值不断变化 因此要通过尿素来加以控制 加入的尿素经脲酶作用发生分解而使发酵液pH值升高 随着氨被利用以及代谢产物的生产又使pH值降低 如此反复直至发酵结束 一般来讲 pH值过高会使菌体自溶 pH值过低导致菌体易衰老 实验研究了一级种子不同终pH值对二级种子生长及发酵产酸的影响 2020 2 9 70 5 2 1一级种子培养液终pH值的影响 为防止pH值过低 在一级种子培养过程中 必须流加尿素 2020 2 9 71 5 2 2一级种子培养基最佳装液量的确定 若装液量过低 溶氧过高 抑制长菌 装液量过高 溶氧不足 菌体呼吸受到抑制 表现为一级种子培养液中乳酸含量过高 菌体生长受到抑制 2020 2 9 72 5 2 3一级种子培养时间的确定 以处于对数生长期中后期为宜 2020 2 9 73 5 2 3一级种子培养时间的确定 选取培养13h的种子接入二级种子培养基进行二级种子培养 经检测 此时残糖在10g L以下 pH7 0 一级种子液谷氨酸含量7 10g L 镜检发现菌体健壮 无杂菌 八字排列明显 2020 2 9 74 5 3二级种子培养条件的确定 为了获得发酵所需的足够数量的菌体 在一级种子培养的基础上尚需进行种子罐的二级种子培养 二级种子培养的目的就是为了使菌体大量扩增 以获得足够数目的具有高活力的菌体 因此 对于二级种子培养来说 培养基组成 pH 温度 通风量 接种量 培养时间等培养条件都应尽可能地控制在最适范围内 为此 必须研究二级种子培养基组成 不同通风量 不同接种量 不同培养时间对二级种子生长和发酵产酸的影响 2020 2 9 75 5 3二级种子培养条件的确定 5 3 1应用正交设计试验优化二级种子培养基5 3 2二级种子生长曲线的测定5 3 3二级种子最佳培养温度的确定5 3 4最佳接种量的确定5 3 5二级种子培养过程曲线的绘制 2020 2 9 76 5 3 1应用正交设计试验优化二级种子培养基 二级种子质量直接影响发酵的成败 而二级种子的好坏与二级种子培养基配比有很大关系 二级种子培养基应使二级种子生长快速 旺盛 以保证发酵高产 稳产 谷氨酸发酵一般要求二级种子培养时间不宜过长 以避免种子老化 缩短发酵周期 根据实际情况 采用摇瓶方式将温度敏感突变株CN1021接入不同配比的二级种子培养基中 培养至对数生长中后期 然后接入发酵培养基 摇瓶发酵42小时 以产酸为指标 决定二级种子培养基的最佳配比 实验所用二级种子培养基的主要成份有 淀粉水解糖 玉米浆 菌体水解液 K2HP04 故进行四因素三水平的正交试验 由于因子个数和正交表的列数相等而没有误差列 因此必须做重复实验 每种实验重复三次 2020 2 9 77 5 3 1应用正交设计试验优化二级种子培养基 2020 2 9 78 2020 2 9 79 5 3 1应用正交设计试验优化二级种子培养基 2020 2 9 80 5 3 1应用正交设计试验优化二级种子培养基 2020 2 9 81 在26h左右二级种子培养液OD净增0 8 二级种子培养液中谷氨酸含量大于30g L 菌体健壮 八字排列明显 故选取培养26h的二级种子接入6m3发酵罐进行发酵 5 3 2二级种子生长曲线的测定 2020 2 9 82 5 3 3二级种子最佳培养温度的确定 据文献报道 谷氨酸生产菌一级种子培养温度一般控制在28 34 根据实验结果 二级种子培养温度应控制在30 若二级种子培养温度过低 则菌体生长不好 培养周期长 若二级种子培养温度过高 则菌体易衰老 发酵后期产酸速率低 不利于高产酸 2020 2 9 83 5 3 4最佳接种量的确定 2020 2 9 84 5 3 5二级种子培养过程曲线的绘制 2020 2 9 85 5 46m3发酵罐发酵条件的研究 谷氨酸强制发酵的特点是高生物素 大接种量 高通风量 采用