Cocktail探针药物法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的应用.doc

Cocktail探针药物法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的应用刘高峰 甄立棉(哈尔滨医科大学附属第二医院药学部，黑龙江省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨150086)摘 要：细胞色素P450是人体内最重要的药物代谢酶，中药可抑制或诱导某个或某些细胞色素P450亚酶，从而影响合用药物的代谢，导致药物相互作用发生。对于中药的代谢研究，是中药现代化研究的重要方面，并可提高中药使用的有效性和安全性，促进临床合理用药。Cocktail探针药物法能全面、真实地反映药物代谢的过程，其优点在于多个代谢途径的信息可在单个实验过程获得，并将个体间影响降至最低，此法省时、经济。Cocktail探针药物法用于中药的代谢研究还是一个比较新的研究领域，近几年开始有文献报道。本文介绍了Cocktail法在中药细胞色素P450酶代谢研究中的国内外应用进展，以期系统了解并指导该领域的研究。关键词：细胞色素P450；中药；Cocktail探针药物法；代谢；研究进展Review on the effects of Traditional Chinese Medicines on cytochrome P450 system by Cocktail probe drugsLIU Gao-feng ZHEN Li-mian(Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of University in Heilongjiang Province, Harbin 150086, China)ABSTRACT Cytochrome P450 are the most important enzymes for drug metabolism. Some Traditional Chinese Medicines (TCM) can reduce or induce one or some cytochrome P450, and therefore affect combined drug metabolism and result in drug interactions. Studies on metabolism of TCM could enhance effectiveness and safety of the drug use, and promote reasonable clinical use for drugs, meanwhile accelerate the modern study process of TCM. Cocktail probe drugs can reflect the process of drug metabolism wholly and actually. It can gain more information of several metabolic pathways in only one experiment. It can also reduce the interindividual variation to the lowest. It can save time and money. Studies development of the effects of TCM on cytochrome P450 System by Cocktail are introduced and summed up in this paper, in order to systematically understand and guide studies in this field.KEY WORDS cytochrome P450（CYP450）；Traditional Chinese Medicine；Cocktail probe drugs；metabolism；study development1 Cocktail探针药物法的应用特点细胞色素P450酶系(CYP450) 是人体内最重要的药物代谢酶，与药物代谢密切相关的同工酶有 CYP1A2,CYP2A6,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A41。药物可显著影响药酶细胞色素P450的活性，使其诱导或抑制，并加速或减缓底物和其他药物代谢，这些构成了药物体内过程和药物相互作用的主要机制2。探针药物法指经CYP450代谢的药物,以其代谢物和原型药的比例或速率衡量酶代谢能力变化的方法。两种及两种以上经不同酶代谢的药物同时给予的方法称为“Cocktail”探针药物法,该方法可用于体内外测定CYP450 酶的活性3。“Cocktail”探针药物法可以采用探针药物的清除率或者是探针药物与代谢产物在尿中、血中和唾液中的浓度比值等指标来评价酶的活性，采用液相色谱或者液相色谱质谱串联法等进行测定3。Cocktail 法的优点在于多个代谢途径的信息可在单个实验过程获得，并将个体间影响降至最低，此法省时、经济。Cocktail”法摒弃了体外研究中实验模型与体内真实环境差异大、不能较好反应体内代谢全过程等的缺点，能全面、真实地反应药物代谢的过程4。现就国内外Cocktail探针药物法在中药CYP450代谢研究中的应用进行综述,为该领域的研究工作提供参考。2 用Cocktail法研究中药有效成分对CYP450的影响（见表1）2.1 倍半萜内脂类 Sara Asimus5等研究了有关青蒿素类药物对不同细胞色素P450酶的影响，用咖啡因，香豆素， 美芬妥英，美托洛尔，氯唑沙宗和咪唑安定6种探针药物分别考查青蒿素等药物对CYP1A2, CYP2A6，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYP3A的活性的影响。结果显示，二氢青蒿素、蒿甲醚对CYP1A2有抑制作用，青蒿素第1天使CYP1A2活性下降，第5天使CYP1A2活性增加；上述几种青蒿素类药物对CYP2A6的活性均无影响；青蒿素、蒿甲醚使CYP2C19的活性增加；二氢青蒿素对CYP2D6有抑制作用，青蒿素第1天使CYP2D6活性下降，第5天使CYP2D6活性增加；青蒿素对CYP2E1有抑制作用；上述几种青蒿素类药物均对CYP3A有诱导作用。2.2 生物碱类Yong-Mei Yao6等利用Cocktail法对青藤碱的代谢进行了研究。用6个探针药物（咖啡因CYP1A2、咪达唑仑CYP3A4、氯唑沙宗CYP2E1、S-美芬妥英CYP2C19、美托洛尔CYP2D6、甲苯磺丁脲CYP2C9）进行人体外研究,用5个探针药物（咖啡因CYP1A2、咪达唑仑CYP3A4、氯唑沙宗CYP2E1、S-美芬妥英CYP2C19、美托洛尔CYP2D6）进行人体内研究，发现青藤碱使CYP2C19的活性降低，对其它CYP450酶无显著影响。2.3 黄酮类H-H.Sherry Chow 7等用Cocktail法考查了绿茶儿茶素对CYP450的影响，健康志愿者经过四周的清洗期后，给予4个探针药物咖啡因CYP1A2、右美沙芬CYP2D6、氯沙坦CYP2C9和丁螺环酮CYP3A4，再进行四周绿茶儿茶素的干预试验，结果发现绿茶儿茶素的干预并没有改变CYP1A2， CYP12D6， CYP12C9的活性，却使CYP3A4活性有稍微的降低。2.4 皂苷类刘昌孝院士4等使用4种探针药物氨苯矾、咖啡因、氯哇沙宗和奥美拉唑，评价人参皂苷Re对大鼠肝细胞色素氧化酶P450亚型CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19的诱导或抑制作用。分两组进行:(l)大鼠尾静脉同时注射探针药物氨苯砜（CYP3A4）、咖啡因（CYP1A2）。(2)大鼠尾静脉同时注射探针药物氯唑沙宗（CYP2E1）、奥美拉唑（CYP2C19）。结果表明人参皂苷Re对大鼠肝细胞色素氧化酶P450亚型CYP1A2、CYP3A4有诱导作用，对CYP2E1、CYP2C19无影响。表1 Cocktail法研究中药有效成分对CYP450的影响中药有效成分 Cocktail法中CYP探针药物 对CYP各亚型的影响倍半萜内酯类青蒿素 二氢青蒿素 蒿甲醚 青蒿琥酯生物碱类青藤碱黄酮类化合物 绿茶儿茶素皂苷类 人参皂苷Re1A2 2A6 2C19 2D6 2E1 3A 咖啡因 香豆素 美芬妥英 美托洛尔 氯唑沙宗 咪唑安定 1A2 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 (体外) 咖啡因 甲苯磺丁脲 S-美芬妥英 美托洛尔 氯唑沙宗 咪达唑仑 1A2 2C19 2D6 2E1 3A4 (体内) 咖啡因 S-美芬妥英 美托洛尔 氯唑沙宗 咪达唑仑 1A2 2C9 2D6 3A4 咖啡因 氯沙坦 右美沙芬 丁螺环酮（1） 1A2 3A4 咖啡因 氨苯砜 （2） 2C19 2E1 奥美拉唑 氯唑沙宗 1A2 2A6 2C19 2D6 2E1 3A+ 0 + + - + - 0 0 - 0 + - 0 + 0 0 + 0 0 0 0 0 + 1A2 2C9 2C19 2D6 2E1 3A4 (体外) 0 0 - 0 0 0 1A2 2C19 2D6 2E1 3A4 (体内) 0 - 0 0 01A2 2C9 2D6 3A4 0 0 0 - （1）1A2 3A4 + + （2）2C19 2E1 0 0 注：0药物对CYP亚型无影响. + 药物对CYP亚型有诱导作用. - 药物对CYP亚型有抑制作用3 用Cocktail法研究中药提取物对CYP450的影响（见表2）3.1 同一种Cocktail法对几种中药提取物分别进行代谢研究Matthias Unger等8用Cocktail法在体外检测中药提取物对6种主要的CYP450酶的抑制作用。CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶的底物经混合，孵化，最终代谢产物用LC/LC/MS定量。Cocktail探针药物包括他克林(CYP1A2)、紫杉醇(CYP2C8)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、米帕明(CYP2C19)、右美沙芬(CYP2D6)和咪达唑仑 (CYP3A4)。钩果草提取物对CYP1A2和2D6的抑制活性相对较低(IC50900g/mL)，对CYP2C8/9/19和3A4的抑制范围是IC50100350g/mL。龙牙草提取物的IC50值在低于100g/mL时对CYP1A2/2C9有较强的抑制活性，100200g/mL时对CYP2C8/19/3A4有较强抑制活性。葡萄柚汁在体外对CYP450的抑制活性相对于体内较弱(IC50400g/mL)。红三叶草提取物IC50值在100500g/mL时可降低各种CYP450酶的活性。胡椒属薄荷油在500g/mL时会使各种CYP450酶（CYP3A4除外）的活性降低到20%。桉油对CYP450的抑制活性比薄荷油低，IC50值范围是大于100g/mL，对CYP3A4的抑制活性相对较强。卡法根提取物抑制所有CYP450的活性，IC50值在20100g/mL时抑制CYP1A2/2C9/2C19的活性，在100500g/mL时抑制CYP2C8/2D6/3A4的活性。3.2 姜黄扈金萍等9通过对大鼠进行体外实验来价姜黄提取液对CYP450的影响，Cocktail探针药物包括咖啡因（CYP1A2）、氨苯砜（CYP3A4）、氯唑沙宗(CYP2E1)，结果显示姜黄提取液对大鼠CYP1A2和CYP2E1有抑制作用，但对大鼠CYP3A4的影响不显著。3.3 连翘闫淑莲10等用Cocktail法考查了连翘提取液对CYP450酶的影响，Cocktail探针药物包括咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗，分别检测CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1的活性。结果显示连翘提取液对大鼠CYP1A2有抑制作用，对大鼠CYP3A4有诱导作用，但对大鼠CYP2E1的影响不显著。3.4 圣约翰草（即贯叶连翘）Zaiqi Wang等11用Cocktail法检测了圣约翰草提取物体内对CYP450活性的影响研究，Cocktail探针药物包括：甲苯磺丁脲（CYP2C9）、咖啡因（CYP1A2）、右美沙芬（CYP2D6）、口服咪达唑仑（肠道壁和肝脏CYP3A）和静脉注射咪达唑仑（肝CYP3A）。结果显示，短期内给予圣约翰草提取物并没有影响CYP450的活性，长期摄入圣约翰草提取物会对肠道壁CYP3A有显著的选择性诱导作用，圣 约翰草提取物不改变CYP2C9、CYP1A2或CYP2D6的活性。表2 Cocktail法研究中药提取物对CYP450的影响中药提取物 Cocktail法中CYP探针药物 对CYP各亚型的影响钩果草提取物 龙牙草提取物 葡萄柚汁 红三叶草提取物 胡椒属薄荷油 桉油 卡法根提取物1A2 2C8 2C9 2C19 2D6 3A4 他克林 紫杉醇 甲苯磺丁脲 米帕明 右美沙芬 咪达唑仑 1A2 2C8 2C9 2C19 2D6 3A4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -姜黄提取液1A2 2E1 3A4 咖啡因 氯唑沙宗 氨苯砜 1A2 2E1 3A4 - - 0连翘提取液1A2 2E1 3A4 咖啡因 氯唑沙宗 氨苯砜 1A2 2E1 3A4 - 0 +圣约翰草提取物 2C9 1A2 2D6 3A(肠壁/肝) 3A(肝) 甲苯磺丁脲 咖啡因 右美沙芬 咪达唑仑(口服) 咪达唑仑(静注) 1A2 2D6 2C9 3A 0 0 0 +（长期）注：0药物对CYP亚型无影响. + 药物对CYP亚型有诱导作用. - 药物对CYP亚型有抑制作用4 讨论目前欧美各国己经把CYP450及其同功酶的测定用于新药的筛选及代谢研究，并把它列为新药申报必须进行的一项试验。我国在该领域的研究还处于探索阶段，但该研究的重要性和意义已逐渐被认识，在我国新药审批办法和药品注册管理办法中，已经要求新药研发必须进行药物代谢酶的研究。另外，国家在化学药物非临床药代动力学研究指导原则中指出，对于创新药物,应观察药物对药物代谢酶,特别是细胞色素P450 同工酶的诱导或抑制作用。因此,简便快速的“鸡尾酒法”将成为一个创新药物临床前药物代谢研究重要的和常用的手段。Cocktail探针药物法在国外应用的较多，主要用于西药的研究。用Cocktail法研究中药的代谢，国内外报道均比较少，是一个比较新的研究领域，目前的报道尚仅限于中药单一有效成分或单一中药提取物，对于复方中药的研究尚属于空白。由于Cocktail法在研究药物代谢方面的优势，若广泛用于中药的代谢研究，必将促进中药基础理论的研究和中药的现代化研究，同时，对于中药在临床上的合理应用，提高联合用药的安全性和有效性具有重要的实际意义。参考文献1 樊慧蓉,和 凡,刘昌孝.Cocktail 探针药物法用于评价细胞色素 P450 同工酶影响的研究进展J. 中国药学杂志,2006,41(14):1045-1048.2 刘高峰,郭兴蕾.中药对细胞色素P450调控作用的研究进展J.中草药,2008,39（1）：139-143.3 刘 颖,焦建杰,娄建石.“Cocktail”探针药物法的研究进展J.中国临床药理学与治疗学, 2006,11(11):1225-1229.4 樊慧蓉.“Cocktail”探针药物法评价人参皂苷Re对肝细胞色素P450酶亚型的影响D.天津医科大学,2004. 5 Sara Asimusa,Doaa Elsherbinyb,Trinh N. Haic,et al. Artemisinin antimalarials moderatelyaffect cytochrome P450 enzyme activity in healthy subjectsJ.Fundam Clin Pharmacol,2007,21(3):307-316. 6 Yao YM, Cao W, Cao YJ, et al. Effect of sinomenine on human cytochrome P450 activityJ.Clin Chim Acta,2007,379(1-2):113-118. 7 Chow HH, Hakim IA, Vin