苏州大学《生物工程下游技术》复习.doc

第一章 绪论1什么是生物工程的下游技术？对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的动植物细胞组织培养的，酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离，加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术（Downstream Processing），也成为下游工程或下游加工过程。生物工程的下游技术：一般泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量检测所需要的一系列单元操作技术。其中，产品的分离纯化是其最重要的组成部分。2生物工程下游技术的发展历程？(1)、古代酿造业 生物技术产业的历史可追溯到古代的酿造业，它包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。古代的技术比较原始，工场大多是家庭作坊式的，产物基本不经过后处理而直接使用，当然也就没有上下游技术之说了。 (2)、第一代生物技术 第一代（传统）生物工业主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。这一时期，发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。此时开始引入化学工程中成熟的近代分离技术，如过滤、蒸馏、精馏等。 (3)、第二代生物技术 第二代生物技术以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。产品品种、类型迅速增加，不仅有初级代谢产物，也有次级代谢产物；不仅有小分子的物质，也有具生命活性的大分子物质，有些产品的分子结构相当复杂。产品的多样性决定了分离方法的多样性。这期间借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，据报道有80%的化工单元操作技术被引入生物工业。 (4)、第三代生物技术 第三代生物技术一般认为以20世纪70年代末掘起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。此时，生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批对人类十分有益的高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。 3细胞破碎技术？初步分离纯化技术？高度分离纯化技术？细胞破碎技术 细胞破碎是工业化生产胞内物质所必需的技术，已经开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术（见“微生物细胞破碎”一章）。细胞破碎技术的逐渐成熟，使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。 初步分离纯化技术 主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。 高度分离纯化技术 小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。70年代以来，逐渐开发出各种色谱(层析)技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。 4下游技术的一般工艺过程？ 某一具体产品的分离提取工艺还与下列情况有关： （1）是胞内产物还是胞外产物； （2）原料中产物和主要杂质浓度； （3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异； （4）产品用途和质量标准； （5）产品的市场价格； （6）废液的处理方法等。按生产过程划分，生物工程下游技术大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（高度纯化）、成品制作。如下图所示。 （胞外产物） （胞内产物）发酵液 预处理 细胞分离 细胞破碎 碎片分离 提取 精制 成品制作 加热 过滤 匀浆法 离心 沉淀 （重）结晶 浓缩 调pH 离心 研磨法 双水相 吸附 离子交换 干燥 絮凝 膜分离 酶解法 膜分离 萃取 色谱分离 无菌过滤 超滤 膜分离 成型 结晶 图1-1 生物工业下游技术一般工艺过程按生产过程的4个阶段可对下游技术作如下简单归纳： （1）预处理和固液分离 主要技术有过滤和离心。固液分离以除去发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞。 （2）提取（初步分离） 目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后到精制工序创造有利条件。 （3）精制（高度纯化） 目的是除去与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 （4）成品制作 成品形式与产品的最终用途有关。 产品的收得率和质量控制应是贯穿下游技术工艺过程的主线。一般情况下，原料中产品浓度越低，下游技术的成本越高。下游技术的步骤越多，提取收得率也越低。如整个下游过程包括6步操作，每步操作的分步收率为90，则总收率仅为(0.9)6100=53.1，即使各步操作都相当完善，分步收率均达到95，经6步操作后，总收率也只有(0.95)6100=73.5。因此，尽量减少分离提取的操作步骤，减小损失，对于提高总收率是很重要的。 5什么是生物工程下游技术永久性的发展方向和推动力？成本、质量、环境保护将是生物工程下游技术永久性的发展方向和推动力。6清洁生产(Cleaner Production）？清洁生产（Cleaner Production）是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。它包括三方面内容：即清洁生产工艺（技术）、清洁产品、清洁能源。清洁生产工艺是生产全过程控制工艺，包括节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和废物离开生产过程以前，尽最大可能减少它们的排放量和毒性，对必须排放的污染物实行综合利用，使废物资源化。 第二章 发酵液预处理1发酵液有什么特性？微生物发酵液的特性可归纳为：发酵产物浓度较低，大多为1%10%，悬浮液中大部分是水；悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体；性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。 2改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些?其简要机理如何?有关改善发酵液过滤特性的物理化学方法有：调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。一、降低液体粘度根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，可见降低液体粘度可有效提高过滤速率。降低液体粘度的常用方法有加水稀释法和加热法等。采用加水稀释法虽能降低液体粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。而且，单从过滤操作看，稀释后过滤速率提高的百分比必须大于加水比才能认为有效，即若加水一倍，则稀释后液体的粘度必须下降50以上才能有效提高过滤速率。 升高温度可有效降低液体粘度，提高过滤速率，如12Be麦芽汁40时粘度为1.2X10-3Pas，升高至75其粘度可下降一半，过滤速率可加倍1倍。同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。如链霉素发酵液，调酸至pH 3.0后，加热至70，维持半小时，液相粘度下降至1/6，过滤速率可增大：10100倍。使用加热法时必须严格控制加热温度与时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性变质的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响其后的产物分离与纯化。 二、调整pHpH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。 对于氨基酸、蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下，净电荷为零，称为等电点。在等电点下，两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法。如味精生产中，利用等电点(pH3.22)沉淀法提取谷氨酸。对于蛋白质，由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.05.5)。利用酸性来调节发酵液pH值使之达到等电点，可除去蛋白质等酸性两性物质。在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。等电点法提取工艺操作简单，收率60。周期长，占地面积大 图三、凝聚与絮凝采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。除此之外，还能有效地除去杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质量。因此，凝聚和絮凝是目前工业上最常用的预处理方法之一。凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝则是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。 1、凝聚发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主要是吸附溶液中的离子和自身基团的电离。在生理pH值下，发酵液中的菌体或蛋白质常常有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上形成双电层。这种双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。双电层的电位越高，电排斥作用越强，胶体粒子的分散程度也就越大，发酵液过滤就越困难。凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集的现象。电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(mmol/L)称为凝聚值。根据Schuze-Hardy法则，反离子的价数越高，凝聚值就越小，即凝聚能力越强。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+。常用的凝聚电解质有硫酸铝Al2(SO4)318H20(明矾)、氯化铝AlCl36H20、三氯化铁FeCl36H20、硫酸亚铁FeSO47H20、石灰、ZnSO4、MgC03等。2、絮凝采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗粒常常是比较细小的，有时还不能有效地进行分离。采用絮凝法则常可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子(如COOH)或阳离子(如NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。 对絮凝剂的化学结构一般有下列两方面的要求，一方面要求其分子必须含有相当多的活性官能团，使之能和胶粒表面相结合；另一方面要求必须具有长链的线性结构，以便同时与多个胶粒吸附形成较大的絮团，但相对分子质量不能超过一定限度，以使其具有良好的溶解性。根据其活性基团在水中解离情况的不同，絮凝剂可分为非离子型、阴离子型和阳离子型三类。根据其来源的不同，工业上使用的絮凝剂又可分为如下三类：(1)有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物。(2)无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等。(3)天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。 目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺(Polyacrylamide)类衍生物，其絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快，用量少(一般以mg/L计)，适用范围广。它们的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，一般不宜用于食品及医药工业。近年来发展的聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，无毒，可用于食品和医药工业。 絮凝效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。同时，在絮凝过程中，常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。溶液pH值的变化常会影响离子型絮凝剂中官能团的电离度，从而影响吸附作用的强弱。絮凝剂的最适添加量往往需通过试验确定，虽然较多的絮凝剂有助于增加桥架的数量，但过多的添加量反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮疑团的粒径变小，絮凝效果下降。如图31所示为-淀粉酶发酵液中，絮凝剂添加量对絮凝液滤速的影响。从图3-1中可看出，絮凝剂的最适添加量为70mg/L。3、混凝对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理，所以可以单独使用。对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架，所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳，凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而大大提高了絮凝的效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。四、加入助滤剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。这是因为使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微胶体离子被吸附到助滤剂的表面上，从而改变了滤饼结构，它的可压缩性下降了，过滤阻力降低了。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、炭粒、淀粉等，其中最常用的是硅藻土。 助滤剂的使用方法有两种：一种是在过滤介质表面预涂助滤剂，另一种是直接加入发酵液，也可两种方法同时兼用。对于第二种使用方法，使用时需要一个带搅拌器的混合槽，充分搅拌混合均匀，防止分层沉淀。除此之外，选择和使用助滤剂的要点如下：(1) 根据目的产物选择助滤剂品种 (2) 根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种 (3) 粒度选择(4) 使用量的选择五、加入反应剂加入某些不影响目的产物的反应剂，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速率。加入反应剂和某此可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。如在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂，另一方面可使某些蛋白质凝固。 又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能除去钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其他阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高310倍。如发酵液中含有不溶性多糖物质，则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速率。例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5硅藻土助滤剂，从而可使过滤速率提高5倍。 3什么是等电点？等电点沉淀法?对于氨基酸、蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下，净电荷为零，称为等电点。在等电点下，两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法。4. 凝聚与絮凝的区别？5. 如何除去发酵液中的杂蛋白质?(1) 沉淀法 蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。 (2) 变性法 蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性，变性蛋白质的溶解度较小。使蛋白质变性的方法很多，其中最常用的是加热法。加热不仅使蛋白质变性，同时降低液体粘度，提高过滤速率。例如，将柠檬酸发酵液加热至80以上，使蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，即可大大提高过滤速率。使蛋白质变性的其他方法有：大幅度调节pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。如在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH23)或较碱性范围(pH89)使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。变性法存在一定的局限性。如加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。 (3) 吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。例如在四环类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3Fe(CN6)2的胶状沉淀来吸附蛋白质，在生产实际中已取得很好的效果。在枯草芽孢杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而可加快过滤速率。 第三章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离1常用的细胞破碎方法？细胞破碎的目的是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类，表4-2列出了一些主要方法。 1、高压匀浆法（high-pressure homogenization） 2、高速珠磨法（high-speed bead mill） 3、超声破碎（ultrasonication）可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切力有关4、化学渗透法（Chemical permeation） 5、酶溶法（enzymatic lysis）6、微波加热法（microvave heating）7、其他方法2什么是自溶法(Autolysis）？自溶法（Autolysis）是一种特殊的酶溶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身产生的。事实上，在微生物生长代谢过程中，大多都能产生一定的水解自身细胞壁上聚合物结构的酶，以便使生长繁殖过程进行下去。控制一定条件，可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。例如，对谷氨酸生产菌，可加入0.028mol/L Na2CO3和0.018mol/L NaHCO3，配成pH10的缓冲液，再配3%的细胞胞悬浮液，加热至70，保温搅拌20min，菌体即自溶。自溶法在一定程度上能用于生产，最典型的例子是酵母自溶物的制备。自溶法的缺点是对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性；此外，自溶后细胞悬浮液黏度增大，过滤速度下降。 3细胞破碎率的测定？ 1、直接测定法利用适当的方法，计数破碎前后的细胞数即可直接计算其破碎率。对于破碎前的细胞，可利用显微镜或电子微粒计数器直接计数。破碎后，破碎过程所释放的物质如DNA和其他聚合物组分会干扰计数，此时可采用染色的方法把破碎的细胞与未受损害的完整细胞区分开来。例如，破碎的革兰氏阳性菌可染色成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，未受损害的细胞成紫色，而受损害的细胞呈亮红色。 2、目的产物测定法细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物地释放量来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液用离心法分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。 3、导电率测定法Luther等报道了一种利用破碎前后导电率的变化来测定破碎程度的快速方法。细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加。由于导电率的大小与微生物种类、处理条件、细胞浓度、温度和悬浮液中原电解质的含量等有关，因此，正式测定前应预先采用其他方法制定标准曲线。 4论述细胞破碎技术研究的发展方向？如上述的各种破碎方法都有一定的局限性，机械法因高效、廉价、简单而得以工业化应用，但敏感性的物质失活问题，碎片去除以及杂蛋白太多等问题仍有待解决，因此细胞破碎技术远未完善。近几年这方面的论文仍不少，有的已超出了单一的细胞破碎领域，而与上游或下游过程相联系。1、多种破碎方法相结合化学法与酶法取决于细胞壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。在实际操作中，可先用化学法或酶法对细胞进行处理，破坏细胞壁膜的某些物质组成，使壁膜的机械强度下降，随后在用机械法处理，即可大大提高细胞的破碎率。 2、与上游相结合在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、稀释率）等因素对细胞破碎都有影响，因此细胞破碎与上游培养有关。另一方面用基因工程的方法对菌种进行改造也是非常重要的。这方面的工作包括以下内容。（1）培养过程控制 在发酵培养过程的细胞生长后期，加入某些能抑制或组织细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞内产物不经破碎即可直接渗透出来。（2）寄主细胞的选择 选择较易破壁的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌。 （3）包含体的形成 包含体是重组蛋白在原核生物细胞内表达后形成的不溶性组分，是不具活性的蛋白质产物，其密度很大。寄主细胞破碎后，包含体可用密度梯度离心机收集。收集的包含体用变性剂溶解，再除变性剂即可得到恢复活性的蛋白质产品。（4）克隆噬菌体溶解基因 在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。 （5）耐高温产品的基因表达 在细胞破碎和分离过程中，为了防止产品失活而消耗的制冷能耗是相当可观的。如果产品能表达呈耐高温型，杂蛋白仍然保持原特性，那么就可在较高温度下将产品与杂质分开，这样既节省了冷却费用，有简化了分离步骤。3、与下游过程结合细胞破碎与固-液分离紧密相关，对于可溶性产品来讲，碎片必须除净，否则将造成层析柱和超滤膜的堵塞，缩短设备的寿命。因此，在破碎细胞的同时，要考虑所造成的细胞碎片对后分离的影响。例如，多次进行高压匀将虽然可以增加产物的释放量，但是也会造成前次的碎片在下一次的匀浆中被进一步破碎，产生更细小的碎片，给后面的固液分离增加难度。必须从后分离过程的整体角度来看待细胞破碎，进行整体的集成、优化，才能获得最佳的工艺。 5分离出具有活性的蛋白质的一般步骤？破碎细胞 分离出包含体 溶解包含体 目标产物的构型复原 6什么是包涵体，它存在的两面性？包含体（蛋白质产物在胞内凝集成没有活性的固体颗粒）形成的原因比较复杂，到目前为止还不完全清楚。Mitriki和King认为包含体的形成是外源蛋白质在生成的过程中，缺少某些协助因子或者由于周围的物理环境（如温度）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累成包含体。 形成包含体也非全是坏事。包含体蛋白质能够避免遭受宿主蛋白质的降解；同时也不会对宿主细胞造成毒害，影响生长；这可能是为什么大肠杆菌能获得高表达量的原因之一。值得指出的是，包含体颗粒内并不一定都是表达产物，也可能含有其他杂质，如核酸、脂类、杂蛋白等，主要取决于表达系统。 7什么是蛋白质的复性，通常采用什么方法？当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 使蛋白质复性最常用的有两种方法。一种方法是将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，蛋白质开始复性。此法很简单，只需加入大量的水或缓冲液，缺点是增大了加工的液量，降低了蛋白质的浓度。在实际操作中，稀释复性也有策略问题：一次性加入、分几批加入以及缓慢滴加缓冲液常常有不同的结果，而且缓慢滴加的效果往往最好。另一种办法是用透析、超滤或电渗析除去变性剂。其中透析法常在实验室中使用，将溶液对水或缓冲液透析，变性剂透过膜被除去，里面的蛋白质开始复性。此法不增加液体体积，不降低蛋白质浓度，但时间较长，易形成蛋白质沉淀。超滤或电渗析比透析速度快，但要注意这两种过程都存在蛋白质的失活问题。有时包含体中蛋白质含有两个以上的二硫键，其中有可能发生错误连接，在这种情况下，需要在复原之前用还原剂打断-S-S-键，使其变成-SH，复性后加入氧化剂使两个-SH形成正确的双硫键。 2、色谱复性 色谱方法是一种很有效的纯化蛋白质的方法，已成为蛋白质纯化必不可少的手段，其在蛋白质的复性方面所发挥的作用也越来越大。8从细胞破碎到蛋白质复性的工艺路线？机械破碎（高压匀浆，高速珠磨） 离心法提取出包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性；机械破碎 膜分离出可溶性蛋白 变性剂溶解包含体 除变性剂复性；化学破碎（加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 路线的特点是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，在对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。缺点是要经过几次离心才能除去大部分细胞碎片，加工时间较长。路线应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留，因此这条路线的问题较多。膜分离的优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。路线是用化学法破菌，所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包含体，将两道工序合为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后分离带来困难。 9固液分离的方法？离心沉降、微孔膜过滤、双水相萃取、泡沫分离法、避开固液分离的探索扩张床吸附 10离心机的种类？过滤的种类？离心机的种类很多，按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。前者转鼓上开有小孔，有过滤介质，在离心力作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出而得以分离，主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量较高的场合。后者转鼓上无孔，不需过滤介质，在离心力的作用下，物料按密度的大小不同分层沉降而得以分离，可用于液-固、液液、和液液固物料的分离。下面简要介绍生物工业中几种常见的离心分离设备。1、碟片式离心机碟片式离心机是沉降式离心机的一种，1877年由瑞典的DeLaval发明，是目前工业生产中应用最广泛的离心机。如图3-2所示为碟片式离心机简图，机内装有多层碟片，碟片间距离为0.5mm左右。悬浮液由轴中心加入，其中的固体颗粒(或重相)在离心力的作用下沿最下层的通道滑移到碟片边缘处，自转鼓壁排泄口引出；清液(或轻相)则沿着碟片向轴心方向移动，自环形清液口排出，从而达到固液分离的目的。其中倾斜的碟片对固液起着进一步分离的作用，当固体颗粒被带进碟片中时，在离心力的作用下会接触到上面的碟片，形成固相流动层沿碟片流下，从而防止了出口液体中夹带固体颗粒。按卸料方式的不同，碟片式离心机分为人工卸料、自动间歇排料和喷嘴连续排料三种型式。其中第一种为间歇操作，每次操作完成后需停机人工卸料；第二种离心机工作一段时间后，在不停机状态下自动打开转鼓外缘处的固体排泄口，借离心力甩出固相；第三种转鼓外缘装有若干喷嘴，在操作过程中连续排出固相(或重相)。前两种适合于悬浮液固形颗粒含量较少的场合。此外，间歇式操作，固相干度较好；而连续操作固相含液量较大，其固相仍具有流动性。 碟片式离心机的分离因数为100020000，适应于细菌、酵母菌、放线菌等多种微生物细胞悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。它的生产能力较大，最大允许处理量达300m3h，一般用于大规模的分离过程。对于不同的碟片式离心机，可根据要分离的悬浮液物性和离心机的结构参数及转速，计算其最大允许的处理量。v Q2v 其中：d2（s-L）g/18 v 2n/3g（r23-r13）ctgv 式中 Q离心机的最大允许进料量(m3/s) 离心机的角转速度(rad/s) v 固体颗粒的自然沉降速率(m/s) v 与离心机结构有关的常数 v d颗粒直径(m) s固体密度(kg/m3) L液体密度(kg/m3) 液体粘度(Pas) n碟片数 r2、r1碟片的外径和内径(m)碟片的倾斜角度() g重力加速度(m/s2) 2、管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，由于它的转鼓细而长(长度为直径的67倍)，所以可以在很高的转速(转速可达1500050000rmin)下工作，而不至于使转鼓内壁产生过高的应力。管式离心机分离因数高达104(6x105)，除可用于微生物细胞的分离外，还可用于细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子的分离。但由于管式离心机的转鼓直径较小，容量有限，因而生产能力较小。转速相对较低的管式离心机最大处理量可达10m3/h。 管式离心机也是一种沉降式离心机，可用于液液分离和固液分离。当用于液液分离时为连续操作，而用于固液分离时则为间歇操作，操作一段时间后需将沉积于转鼓壁上的固体定期人工卸除。 管式离心机由转鼓、分离盘、机壳、机架、传动装置等组成，如图3-3及图3-4所示。悬浮液在加压情况下由下部送入，经挡板作用分散于转鼓底部，受到高速离心力作用而旋转向上，轻液(或清液)位于转鼓中央，呈螺旋形运转向上移动，重液(或固体)靠近鼓壁。至分离盘靠近中心处为轻液(或清液)出口孔，靠近转鼓壁处为重液出口孔。用于固液分离时，将重液出口孔用石棉垫堵塞，固体则附于转鼓周壁，待停机后取出。 管式离心机设备简单，操作稳定，分离效率高。在生物工业中，特别适合于一般离心机难以分离而固形物含量0.1g/100m1的悬浮液的过滤分离。滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。其中重力过滤设备简单，应用不多，在发酵工业中仅用于啤酒糖化醪的过滤，对发酵醪过滤未见采用。下面简要介绍生物工业中几种常用的过滤方法与设备。1、板框过滤机板框过滤机是一种传统的过滤设备，在发酵工业中广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。与其他设备比较，板框过滤机的优点是：结构简单，装配紧凑，过滤面积大；过滤的推动力(压力差)能大幅度调整，并能耐受较高的压力差，因而固相含水分低，并能适应不同过滤特性的发酵液的过滤；辅助设备少、维修方便、价格低和动力消耗少等。 板框过滤机的主要缺点是设备笨重、间歇操作、劳动强度大、卫生条件差、辅助时间多和生产效率低。自动板框过滤机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装、滤饼的脱落卸出和滤布的清洗等操作都自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间并减轻了劳动强度。板框过滤机比较适合于固体含量110的悬浮液的分离。 2、真空转鼓过滤机对于大规模生物工业生产，真空转鼓过滤机是常用的过滤设备之一。它具有自动化程度高、操作连续和处理量大的优点，特别适合于固体含量较大(10)的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母菌发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。由于受推动力(真空度)的限制，真空转鼓过滤机一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤。此外，采用真空转鼓过滤机过滤所得固相的干度不如加压过滤。 如图36所示为真空转鼓过滤机的工作原理图。这种过滤机的主要部件是一转鼓，在转鼓内维持一定的真空度，施加于转鼓外边的大气压力即为过滤的推动力。过滤操作时，转鼓下部浸没于待过滤的悬浮液中(过滤区)。当转鼓以低速旋转时(一般为0.12.6r/min)，滤液就透过滤布被吸人转鼓内腔，滤渣则滞留于转鼓表面的过滤介质上形成滤饼。当转鼓继续转动，生成的滤饼依次被洗涤、吸干(洗涤吸干区)和刮下卸除(卸渣区)。最后，为了除去堵塞在滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气通过分配阀的室进入再生区，吹落这些微粒使滤布再生。转鼓转动一周，则完成一个过滤循环。对于预涂助滤剂或在用刮刀卸渣时保留滤饼预留层的场合，则不用再生区。前者可提高过滤速率，后者可提高滤液的澄清度。3、硅藻土过滤机硅藻土是生物工业中应用较为广泛的散粒过滤介质，是一种较纯的二氧化硅矿石。硅藻土密度为100250kg/m3，比表面积1020m2/g，粒度2100m。此种颗粒具有极大的吸附和渗透能力，能滤降0.11.0m的粒子，而且化学性能稳定，它既是优良的过滤介质，同时也是优良的助滤剂，其用法有如下三种： (1) 作为深层过滤介质，以过滤含少量(0.1)悬浮固形物的液体。硅藻土不规则粒子间形成许多曲折的毛细孔道，藉筛分和吸附作用除去悬浮液中的固体粒子。(2) 在支持介质(滤布)的表面上预涂硅藻土薄层(预涂层)，以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高和稳定过滤速率。(3) 将适当的硅藻土分散在待过滤的悬浮液中，使形成的滤饼具有多孔隙性，降低滤饼的可压缩性，以提高过滤速率和延长过滤操作的周期。硅藻土过滤机被广泛用于啤酒生产中的冷凝固物的分离和成熟啤酒的过滤，它还多用于葡萄酒、清酒及其他含有低浓度细微蛋白质胶体粒子悬浮液的过滤。按支撑单元的不同，硅藻土过滤机可分为板框式过滤机、叶片式过滤机和柱式过滤机三种。 第四章 膜分离技术在生物工程中的应用1什么是膜分离技术？膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分，从而达到分离目的的技术。2膜的分类？1、对称膜 对称膜是结构与方向无关的膜 2、非对称膜 非对称膜有一个很薄的，但比较致密的分离层和多孔支撑层，如图9-1所示 3、复合膜 这种膜的选择性膜层(活性膜层)沉积于具有微孔的底膜(支撑层)表面上 4、荷电膜 即离子交换膜，是一种对称膜，含有高度的溶胀胶载着固定的正电荷或负电荷，带有正电荷的膜称为阴离子交换膜，从周围流体中吸引阴离子。带有负电荷的膜称为阳离子交换膜。相对应的有中性膜。另外还有根据膜材料亲疏水性可分为亲水膜和疏水膜。 5、液膜 即液体膜，是从生物膜奇妙的选择性输送功能上得到启发而模仿的一种人工膜 6、微孔膜 孔径为0.0520m的膜 7、动态膜 在多孔介质(如陶瓷管)上沉积一层颗粒物(如氧化锆)作为有选择作用的膜，此沉积层与溶液处于动态平衡 3渗透、透析、反渗透、超滤、和电渗析？渗透是一个扩散过程，在膜的两旁，渗透压差的作用下溶剂产生流动。透析是利用膜两侧的浓度差从溶液中分离出小分子物质的过程。在渗透实验装置的膜两侧制造一个压力差，并使其大于渗透压，就会发生溶剂倒流，使得浓度较高的溶液进一步浓缩，这一现象叫做反渗透。超滤和反渗透及微过滤都是以压力差为推动力。以多孔细小薄膜为过滤介质，使不溶物浓缩过滤的操作为微过滤；按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作为超滤；从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透。在电场中交替装配的阴离子和阳离子交换膜，在电场中形成一个个隔室，使溶液中的离子有选择地分离或富集，这就是电渗析。4膜的浓差极化与膜污染？如何控制膜污染？浓差极化是指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过流量下降。溶剂向膜面流动（对流）引起溶质向膜面流动，当溶质向膜面的流动速度与浓度梯度使溶质向本体溶液扩散速度达到平衡时，在膜面附近存在一个稳定的浓度梯度区，这一区域称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。它只有在运行膜分离过程中才发生。膜的浓差极化容易造成3种情况：(1)提高渗透压，降低水通量。(2)降低膜的截留率。(3)产生结垢现象，造成物理阻塞，使膜逐渐失去透水能力。对于浓差极化现象虽不能完全消除，但操作得当，浓差极化是可以减弱的。膜污染是指处理物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。 膜的污染主要有两种情况：一种是附着层；另种是堵塞。所以，膜污染引起通量衰减往往是不可逆的。而浓差极化是可逆的，即变更操作条件可以使浓差极化消除，而污染则必须通过清洗的办法，才能消除。 膜污染控制的方法有多种，可以通过控制膜污染影响因素，减小膜污染的危害，故在用微滤、超滤分离、浓缩细胞、菌体或大分子产物时，必须注意以下几点：1、膜材料的选择 膜的亲疏水性、荷电性会影响到膜与溶质间相互作用大小。2、膜孔径或截留分子量的选择 当待分离物质的尺寸大小与膜孔相近时，由于压力的作用，溶剂透过膜时把粒子带向膜面，极易产生堵塞作用。3、膜结构选择 通常原则是选择不对称结构膜较耐污染。4、组件结构选择 毛细管式与薄流道式组建设计可以减小浓差极化或凝胶层形成。5、溶液pH控制 溶液pH对蛋白质在水中溶解性，荷电性机构型有很大影响。6、溶液中盐浓度的影响7、溶液温度影响 一般溶液温度升高，其黏度下降，但对某些蛋白质溶液，温度升高，反而会使透水率下降。8、溶质浓度，料液流速与压力的控制5膜分离技术应用实例？1、膜分离技术在纯净水处理中的应用它可以在超纯水制备中作为预处理手段，去除微生物、胶体和大分子物质，以减轻反渗透和离子交换树脂的负担，提高出水质量与再生经济效果，它也可以用在终点过滤，以去除微粒胶体、细菌和有机物。 反渗透是生产用纯净水的主要设备。饮用纯净水生产应用 UF、MF、O3 技术提供优质天然矿泉水生产系统；应用 UF、RO、O3 技术提供瓶装、桶装饮用纯净水生产系统；2、膜分离技术在电子工业用水中的应用电镀废水处理回用技术 传统电镀废水处理方法：化学法，离子交换法，电解法等。 传统方法处理电镀废水所面临的问题 (1)成本过高水无法循环利用，水费与污水处理费占总生产成本15%20% (2)资源浪费贵重金属排放到水体中，无法回收利用 (3)环境污染电镀废水中的重金属为“永远性污染物”，在生物链中转移和积累，最终危害人类健康。采用膜集成技术处理电镀废水典型工艺 采用膜集成技术为电镀废水处理提供完美解决方案，促进电镀工业技术升级。其主要特点： (1) 降低成本水与贵重金属循环利用，减少材料消耗 (2) 回收资源贵重金属回收利用 (3) 保护环境废水零排放或微排放 3、膜分离技术在给水及循环水处理中的应用中水回用建设部城市中水设施管理暂行办法中将中水定义为：部分生活优质杂排水经处理净化后达到生活杂用水水指标（CJ25.1-89），可以在一定范围内重复使用的非饮用水。中水其实就是再生水，水质介于上水和下水之间，故名“中水”。中水虽然不能饮用，但它可以用于一些对水质要求不高的场合。中水回用的对象分市政杂用水、生活杂用水和工业用户。 中水回用处理方法：按目前已被采用的方法大致可分为 4 类： （ 1 ）生物处理法 利用水中微生物的吸附、氧化分解污水中的有机物，包括好氧和厌氧微生物处理，一般以好氧处理较多。 （ 2 ）物理化学处理法以混凝沉淀（气浮）技术及活性炭吸附相结合为基本方式，与传统的二级处理相比，提高了水质，但运行费用较高。（ 3 ）膜分离技术 采用超滤（微滤）或反渗透膜处理，其优点是 SS 去除率很高，